tspan5在胃癌中的表达及调节胃癌细胞增殖机制的研究内科学消化系病专业论文.docxVIP

删4-1-学位论丈 删 4-1-学位论丈 Tspan5在胃癌中的表达及调节胃癌细胞增 殖机制的研究 硕士研究生：何沛嵘 指导教师：姜泊教授；李纪良教授 摘要 背景：胃癌(Gastric Carcinoma，GC)是位于第四位人类最常见肿瘤，也是 肿瘤相关性死亡最常见的原因之一。在2008年，全球总共有989，600新增胃癌 病例和738，000例胃癌估计死亡率，占全球癌症病例总数的8％和估计癌症死亡 总人数的10％。而胃癌发病率最高的地区是在亚洲东部，东欧和南美。近年来， 随着诊断技术的进步及针对肿瘤的外科手术和放化疗治疗策略的成熟，但由于 胃癌的复发、转移，患者的预后仍然并不令人十分满意。此外，尽管TNM (tumor．node—metastasis)临床分期是使用最广泛的分期系统，并对胃癌患者的 预后有提示意义，但它依旧是很难获得患者其它相对具体的临床预后信息。因 此，发展对患者预后进行评估预测的新的生物标志物，对于目前来说是非常迫 切需要的。而且胃癌相关基因及其蛋白分子不仅在了解胃癌的发病机制方面十 分重要，在临床靶向性治疗和改善预后等方面也意义重大。 Tspan5(tetraspanin 5，net4，TMS4SF9)，属于四分子交联体超家族(tetraspanin) 中的一员。Tetraspanin是四次跨膜的小分子细胞膜蛋白(20．50kDa)，其特点是有 四个比较保守的跨膜域(TM)。TM延伸到细胞膜外，形成一个小的胞外环和一个 大的胞外环，而在胞内则形成一个很短的氨基末端和一个羧基末端。Tetraspanin 可以与其他I司是Tetraspanin成员的细胞跨膜受体蛋白通过相互作用形成复合物， 此复合物被称为富含tetraspanin的胞膜微结构域。在人类tetraspanin家族中已有 万方数据 摘要 摘要 33的成员被发现，但只有少数关于该家族成员在哺乳动物细胞上进行研究。有 几项研究分别揭示在tetraspanin家族中，例如TSPANl(NET-I)、 TSPANl3(NET-6)、TSPAN24(CDl 51)、TSPAN27(CD82)、TSPAN28和 TSPAN29(CD9)，表明他们在某些人类癌症中下调或表达升高，这意味着这些 tetraspanin成员可能参与肿瘤发生或肿瘤的进展恶化。而相比之下，关于Tspan5 在肿瘤的发生、发展和转移作用方面则所知甚少。 我们都知道恶性肿瘤的特点是无限增殖，其无限增殖多与细胞周期和细胞 凋亡障碍密切相关。细胞周期进程的失调被认为在肿瘤发生中发挥着重要作用。 大量的研究表明，细胞周期失调在肿瘤复发及进展方面负有很大的责任。在本 文中，我们旨在研究Tspan5在胃癌发生发展中所起的作用及其临床意义。此外， 我们对Tspan5和胃癌细胞周期蛋白变化之间的关系非常感兴趣，希望可以揭示 肿瘤发生发展的机制，发展新的治疗方法和预测疾病预后的生物标志物。 目的： 1明确Tspan5在临床胃癌组织标本中的表达情况，与胃癌患者病情发展、 预后的关系。 2探讨Tspan5在影响胃癌细胞增殖、生长方面的生物学作用。 3在体内外探讨Tspan5对胃癌细胞周期的影响及其相关机制。 4探讨Tspan5在影响胃癌细胞侵袭转移方面的生物学作用。 方法： 1采用组织免疫化学染色的方法在114例临床胃癌组织标本中，分析Tspan5 的表达量与临床胃癌发展、预后的关系。 2基于基因克隆技术，将Tspan5片段克隆到逆转录病毒表达质粒 pincx2．GFP．IRES中，经酶切、测序鉴定正确无误后，与pVSV-G共转染至GP2．293 细胞中进行病毒包装。将包装的高表达逆转录病毒感染胃癌AGS和MKN45细 胞，而后经G41 8初步筛选形成稳定株，然后经Western blot鉴定后，扩大培养、 冻存稳定细胞株。 3 CCK．8法检测稳定高表达Yspan5的重组细胞的增殖生长情况，同时用平 II 万方数据 硕士学位论文 硕士学位论文 板克隆形成实验检测重组细胞在体外克隆形成的能力，然后将重组胃癌细胞在 裸鼠皮下接种成瘤，观察其在裸鼠体内的成瘤能力。 4通过流式细胞术分析Tspan5对胃癌AGS和MKN45细胞周期的影Ⅱ向。同 时，通过蛋白电泳及瘤体组织片免疫组化对重组胃癌细胞周期蛋白分子Cyclin D1、CDK4、p15、p27、E2F1和pRB的变化进行验证。 5细胞趋化运动和侵袭转移实验，划痕实验分析Tspan5在重组胃癌AGS 和MKN45细胞在体外的转移能力所起的作用。 结果： l在114例临床标本中，通过免疫组化染色显示，Tspan5低表达于胃癌组 织而高表达于相应癌旁组织。在癌组织中，Tspan5的表达量的高低与肿瘤大小、 肿瘤侵袭程度、肿瘤淋巴结转移和临床TNM分期密切