2017-18学年高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离练习.docxVIP

课题3血红蛋白的提取和分离 1．透析法分离蛋白质的目的是除去小分子杂质。2．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。 1．透析法分离蛋白质的目的是除去小分子杂质。 2．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。 3．在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。 4．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子的大小。 5．蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、纯化和纯度鉴定。 6．在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 蛋白质分离的原理和方法 [自读教材·夯基础] 1．蛋白质分离的理论依据 2．分离的方法 (1)凝胶色谱法： ①概念：也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 ②凝胶eq \b\lc\{\rc\ (\a\vs4\al\co1(形态：微小的多孔球体,组成：大多数由多糖类化合物构成,结构：内部有许多贯穿的通道)) ③原理：相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的时间较长；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。 (2)电泳： ①概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。 ②原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③影响电泳速率的因素： ④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3．缓冲溶液 (1)作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。 (2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。 [跟随名师·解疑难] 1．凝胶色谱法 (1)凝胶：是一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道，具有多孔的凝胶，又称为分子筛。 (2)原理： 项目 相对分子质量大 相对分子质量小 直径大小 大于凝胶颗粒空隙直径，被排阻在外面 小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部 运动方式 垂直向下移动 无规则扩散进入凝胶颗粒 运动速度 较快 较慢 运动路程 较短 较长 洗脱次序 先从凝胶柱洗脱出来 后从凝胶柱洗脱出来 2．电泳的常用方法 (1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。 (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳： ①凝胶形成： ②加入SDS的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 [特别提醒]　测定蛋白质相对分子质量通常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定性强，可用检测仪直接测定。 实 验 操 作 [自读教材·夯基础] 1．样品处理 (1)红细胞的洗涤： ①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。 ②过程： (2)血红蛋白的释放： ①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。 ②过程： (3)分离血红蛋白溶液混合液离心eq \o(――→,\s\up7(分离))用滤纸过滤除去脂溶性沉淀层―→分液漏斗中静置片刻―→分离出下层红色透明液体。 2．粗分离——透析 (1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12 h。 (2)目的：将相对分子质量较小的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 3．纯化 (1)通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。 (2)过程： 4．纯度鉴定 在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 1．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？ 提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。 2．在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？ 提示：加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂以释放血红蛋白。 3．血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？ 提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 [跟随名师·解疑难] 1．分离血红蛋白溶液