不同来源的艰难梭菌其毒素mlst分型及药敏情况的分析临床检验诊断学专业论文.docxVIP

I博士学位论文 I 博士学位论文 现了耐甲硝唑和对万古霉素中介哆墓株。且用这两种药物治疗复发率高达25％ ．60％。针对此现状，出现了一种治疗CDI的新抗生素．非达霉素(Fidaxomicin)。 该药物是靶向治疗艰难梭菌，己被在美国FDA批准上市。替加环素在欧美已有 不少成功治疗艰难梭菌感染的报道，有报道称替加环素可显著减少艰难梭菌芽 孢生成率，这也可能是其有效治疗CDI的原因之一。替考拉宁是一种新型糖肽 类抗生素，其抗菌谱与万古霉素相似，欧洲CDI治疗指南认为，在所有的治疗 过程中，替考拉宁均可以替代万古霉素。 莫西沙星是第四代氟喹诺酮类广谱抗菌药物，主要是通过抑制细菌DNA螺 旋酶和拓扑异构酶的活性，阻断DNA的复制而发挥杀菌作用。目前已经将氟喹 诺酮类药物的使用看作一个独立的危险因素，因其与CDI发病率的增加有明显 相关关系。有研究表明艰难梭菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制主要是喹诺酮耐 药决定l又(quinolone resistance determining region，QRDR)DNA旋转酶基因gyrA 或gyrB发生位点突变，导致抗生素无法结合上去从而表现出耐药。是否还存在 其他耐药机制有待进一步研究。 为了了解不同来源的艰难梭菌在MLST分型、毒素基因表达及其调控方面 的差异，我们对来源于成人和婴幼儿的艰难梭菌菌株进行相应的研究，同时了 解这些菌株对目前CDI治疗常用抗菌药物的敏感性及其耐药基因产生的情况。 方法 收集2014年3月至2015年4月，来源于广州军区广州总医院住院患者有 腹泻症状的成人粪便标本675份、及广东省妇幼保健院健康婴幼儿(2岁)粪便标 本618份。将新鲜粪便接种于平板培养基上在35。C温箱厌氧孵育48h，挑选可 疑菌落进行两次耐氧试验后通过APl20A厌氧鉴定条进行鉴定或扩增艰难梭菌 16srRNA特异性片段加以鉴定。16srDNA引物根据NCBI艰难梭菌参考菌株630 设计。通过PCR方法鉴定所有菌株毒素基因的tcdA、tcdB。同时对毒素基因阳 性的菌株进行MLST分型，根据Griffiths设计的七对看家基因引物测序，将每 一份样品中测定的7管家基因序列(adk、atpA等)提交到公用数据库(塾地； III 万方数据 摘要／／pubmlst．Org／Clostridium 摘要 ／／pubmlst．Org／Clostridium difficile)@比对，获得相应的等位基因谱，然后将等位 基因图谱提交到科克大学的公开数据库(http：／／mlst．ucc．ie／mlst／)获得ST型，若 数据库中不存在的型别认为是新的sT型。将7个等位基因的序列合并成1个大 序列，使用clustalx软件将64个样品的序列进行Alignment对齐，然后在MEGA 7．O上使用Maximum likelihood(ML)法构建进化树。 将67株含有毒素基因的艰难梭菌厌氧培养48小时候后，挑取若干菌落将 浊度调到3．o麦氏单位，用CDAB检测试剂条在全自动免疫荧光分析仪上检测 艰难梭菌A／B毒素。利用测序的方法检测毒素基因tcd．4、tcdB的负调控基因tcdC 的突变位点，分析突变位点与毒素表达的关系。同时进行细胞毒素试验：调取 三株来源于成人毒素基因和毒素检测都阳性的菌株，与三株来源于儿童毒素基 因阳性而毒素表达阴性的菌株，接种到预制好的10ml脑心浸液肉汤中，厌氧环 境35。C培养48h，离心过滤取上清感染Vero细胞。将培养基换成含有1／10菌液 上清的培养基，培养箱里孵育1h，用PBS洗三次之后再换成正常的完全培养基， 继续培养24小时，次日在显微镜下观察Vero细胞的形态。 将待测菌培养48h后每个标本挑取菌液o．5麦氏单位，涂布到提前制备好的 布氏琼脂平板上，再贴上Etest条放于厌氧罐中37。C培养48h。每次试验分别加 入2个空白对照，即将试验菌株点种于强化布氏琼脂平板中，一个置于有氧环 境，一个置于无氧环境中37。C培养48 h。48h读取抑菌圈最下缘的数值，记录 每株菌对每个药物的MIC值。89株艰难梭菌(含62株毒素基因阳性和27株毒 素基因阴性的菌株)测定了万古霉素、甲硝唑、莫西沙星、替加环素及替考拉 宁等五个药物，另将9株A．B+的菌株加测四个抗生素：克林霉素，红霉素，左 氧氟沙星和利福平。Whonet5．6分析药敏结果 对莫西沙星耐药的菌株进行氟喹诺酮耐药决定区基因的检测，按照Denise Drudy[8]等的方法通过PCR检测DNA旋转酶亚单位gyrA和gyrB基因。所得 DNA序列采用Clustal X进行比对。 采用高通量测序的方法检测9株A．B+菌株的SNPs数，分析突变位点，同 IV 万方数据 博士学位论文时看菌株上是否存在大环内酯类、林可霉素类、链霉素(