传染性法氏囊病毒粒子感染及其a节段编码基因转化细胞的转录本初步分析微生物学专业论文.docxVIP

新江大学博士学位论文：摘要摘要 新江大学博士学位论文：摘要 摘要 传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，璐DV侵染鸡法氏囊组织的B 淋巴母细胞，导致严重的免疫抑制。为了探索IBDV感染及其编码基因转化对宿主细胞 代谢的影响，本论文以Vcro细胞为模型，利用LongSAGE技术(Long serial analysis of gene expression,LongSAGE)，对IBDV感染，A节段、VP2／4／3、VP5基因转染的Veto 细胞进行基因表达差异分析，从不同角度挖掘病毒感染过程中，细胞基因表达的调控网 络关系，寻找病毒感染与细胞抗病毒过程中重要的基因及其相关通路。 (一)传染性法氏囊病病毒A节段eDNA克隆 以传染性法氏囊病病毒NB株 (弱毒株)基因组dsRNA为模板，采用LA．PCR一步法扩增并克隆了IBDV基因组A 节段全长cDNA。序列测定结果表明，IBDV基因组A节段全长共3,259个核苷酸，包 括5’、3’-端的非编码区(NCR)和两个部分重叠的开放阅读框(ORFl和ORF2)，与 GcnBank中IBDV其他毒株同源性为81．8．99．9％，与JDl、Cu．1、P2、CEF94等毒株的 关系最近，面与欧洲、香港、日本的超强毒株和美国的变异株相对较远。其中ORFl编 码1012个氨基酸的多聚蛋白(VP删3)与JDl同源性高达99．5％，VP2片段与JDl、 CEF94和D78同源性为99．8％，VP3片段与JDI同源性99．2％，VP4片段与JDl同源 性100‰VP5片段与JDl、Hz2、P2、CEF94、CT、Cu-I和D78同源性99．3％。 (二)表达IBDV编码基因的Vero克隆化细胞系构建 将IBDV A节段、 VP2／4／3、VP5、VP2、VP3等基因片段分别克隆入真核表达载体pEGFP-C2和pCI-neo， 构建了pEGFP-VP5、pEGFP-pVP2系列、pCl-neo-A、pCl-neo-VP2／4／3、pCI-neo-VP5、 pCl-neo-VP3、pCI-neo-pVP2系列等21种真核表达质粒，在Lipofectamine 2000介导下 转染Vero细胞，利用荧光显微镜进行蛋白表达分析，结果显示：pEGFP．VP5转染Veto 细胞后4-Sh，能在细胞膜周围观察到与EGFP融合表达的VP5蛋白；pEGFP-pVP2系 列蛋白在转染后9．12h开始出现绿色荧光细胞。在此基础上运用非融合表达的pCl-neo 重组真核表达质粒转染Vcro细胞，在G418抗性筛选下，进行表达IBDVA、VP2／4／3、 VP5、vP2、VP3细胞的克隆，通过PCPJSouthcrnblot、RT-PCR／Northcrnblot、IFA／IPMA 等鉴定，获得了以下克隆化细胞系：获得了2株A节段可稳定表达其编码蛋白VP2、 VP4、VP3和VP5蛋白的克隆化细胞系；获得了3株能稳定表达VP2、VP4、VP3的含 Ⅵ’硝／3基因克隆化Voro细胞；获徭了7株能稳定表达IBDVVP5蛋白的克隆化细胞； 获得了17株能持续性表达不同VP2截短蛋白的克隆化细胞系；获得了3株稳定表达 VP3蛋白的克隆化细胞系。 (三)LengSAGE文库构建及数据分析 应用LongSAGE技术，分别从IBDV 感染的Vcro细胞、Vero-A+9C4细胞、Vero-VP2／4／3+4(38细胞、V酊V_p5+2Fll细胞及 正常Veto细胞中抽提mRNA，建立了5个LongSAGE文库。验证转化效率与转化子大 小后，各文库随机选取2000个插入片段大于500bp的转化子进行DNA测序分析。共 Vl 浙江大学博士学位论文；摘要获得代表24475(占总标签数的25．44％)种不同转录本的96213个随机标签，3124种 浙江大学博士学位论文；摘要 获得代表24475(占总标签数的25．44％)种不同转录本的96213个随机标签，3124种 转录本能与在人类染色体上找到相应位置(定位率为12．76％)。其中，从IBDV感染 的Vero细胞库中获得代表9187种不同转录本的22193个标签；从正常Vero细胞库中 获得代表8369种不同转录本的17663个标签；从Vero-VP5细胞库中获得代表7130种 不同转录本的14221个标签；从Vero-A细胞库中获得代表10160种不同转录本的22968 个标签；从Vero-VP2／4／3细胞库中获得代表8840种不同转录本的19168个标签。 库间转录本表达差异分析显示：与正常的细胞相比较(P0．05)，IBDV感染的细 胞出现37种转录本表达上调、84种转录本表达下调，Vero-A细胞出现40种转录本表 达上调、104种转录本