儿茶酚胺调节人单核细胞来源树突状细胞迁移功能及其机制研究内科学心血管病专业论文.docxVIP

儿茶酚胺调节人单核细胞来源树突状细胞迁移功能及其机制研究于两要 儿茶酚胺调节人单核细胞来源树突状细胞迁移功能及其机制研究 于两要 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是慢性炎症免疫性疾病，树突状细胞(Dendritic cells，DCs)在其中起重要作用，最近发现树突状细胞外迁受阻是斑块内细胞聚集、 局部炎症加重的机制之一，但调节DC外迁的因素和机制还不清楚。心理社会因素是 AS和心血管事件的独立危险因素，儿茶酚胺(Catecholamines，CAs)是慢性应激反 应中主要的神经递质，主要包括肾上腺素(Epinephrine，EPI)和去甲肾上腺素 (Norepinephrine，NE)。动物研究已证实，DCs表面存在多种肾上腺素能受体 (Adrenergic receptor，AR)，肾上腺素和去甲肾上腺素等神经递质，介由DAR参与 DCs细胞迁移功能的调控，因此可能是AS条件下调节DC细胞迁移的因素之一。本 研究以儿茶酚胺为干扰因素，观察其对体外培养的人单核细胞来源树突状细胞迁移功 能和趋化因子受体(Chemokine Receptors，CCR)表达的影响并探讨其机制，将为慢 性应激在AS发病中的作用机制研究提供新理论，为应用B．受体阻滞剂治疗AS提供 新的佐证。 第一部分成人外周血单核细胞来源树突状细胞的分离培养 和诱导分化 目的：研究健康成人外周血单核细胞来源树突状细胞的生物学特性和诱导分化的 条件。 方法：用密度梯度离心法分离健康成人单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs)，贴壁法或免疫磁珠分选法获得单核细胞，经含重组人粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子(Recombinant Human Recombinant Human Granulocyte macrophage—colony stimulating factor，rh-GM-CSF)(50ng／m1)、重组人白细胞介素4 (Recombinant Human Interleukin-4，rh．IL4)(20ng／m1)和lO％胎牛血清的1640培养 基培养，观察细胞形态以及集落、树突的出现时间，第6天收集悬浮细胞，流式细胞 仪鉴定DCs的表面标记。第6天加入LPS(200ng／m1)诱导成熟，第8天收集悬浮细 胞，流式细胞仪鉴定表面标记。 结果：(1)形态学观察：磁珠分离的单核细胞形态均匀一致，纯度达96％以上， 加入细胞因子rhGM．CSF、rhlL4诱导分化。最初细胞呈贴壁样生长，24小时后细胞 体积逐渐增大，大部分细胞悬浮，并聚集成集落样生长；第六天集落周围有典型毛刺 状突起的细胞脱落。(2)流式鉴定：第六天收集细胞，流式细胞仪检测发现贴壁法获 得单核细胞诱导分化后，CDla阳性率在0．697+0．053； CDIlc阳性率O．578+0．062； 第二军医大学博上论文磁珠分选法获得单核细胞诱导分化后，CDla阳性率在0．953+0．026；CDl 第二军医大学博上论文 磁珠分选法获得单核细胞诱导分化后，CDla阳性率在0．953+0．026；CDl lc阳性率 0．998士0．046。加入LPS(200n∥m1)诱导成熟，48小时后流式细胞仪检测发现LPS 组细胞与对照组相比CD86表达上调54．73％，HLA．DR表达上调45．09％，CCR7表 达上调53．98％(p0．01)。 结论：在一定条件下，成人PBMCs可以诱导分化为DCs，并在LPS作用下诱 导成熟，高表达抗原递呈分子、共刺激分子和与迁出组织有关的趋化因子受体。 第二部分儿茶酚胺对人树突状细胞迁移能力和趋化因子受体 表达的影响 目的：探讨儿茶酚胺对DCs迁移能力和CCR7表达的影响。 方法：磁珠分选法纯化人外周血单核细胞，经rh．GM—CSF和rh．IL4诱导分化为 不成熟DCs，细胞培养第6天分别加入LPS、不同浓度的肾上腺素或去甲肾上腺素 (10～、10一、10巧M)，或LPS加上不同浓度的肾上腺素或去甲肾上腺素干预24小时， 用transwell小室检测DCs向MIP．3B的迁移能力；用荧光定量逆转录聚合酶链反应 (RT．Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)和流式细胞仪检测CCR7基因和蛋白的表 达；按照ELISA试剂盒操作步骤测定收集的上清液中ILl0的浓度。在研究肾上腺素 能受体作用的实验中，加入儿茶酚胺前，分别加入眠pl、p2、p、a+13受体阻滞剂 (10巧M)作用30分钟。 结果：肾上腺素和去甲肾上腺素不影响DC的凋亡和成熟(CD86，，HLA．DR)， 但均可抑制LPS诱导成熟的DCs向MIP．3p迁移(pO．05)。肾上腺素下调成熟DC 表达CCR7，而去