trail基因重组卡介苗的构建及对膀胱肿瘤杀伤作用的研究外科学泌尿外科学专业论文.docxVIP

浙扛大学博士学位论文—摘要“TRAIL基因重组卡介苗的构建及对膀胱肿瘤杀伤作用的研究TRAIL基因重组卡介苗的构建及对膀胱肿 浙扛大学博士学位论文—摘要“TRAIL基因重组卡介苗的构建及对膀胱肿瘤杀伤作用的研究 TRAIL基因重组卡介苗的构建及对膀胱肿 瘤杀伤作用的研究· 浙江大学医学院 外科学(泌尿外科) 博士研究生 陈善闻 导师 沈周俊教授 中文摘要 一、研究目的 获得高效、稳定表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAII，)蛋白的重组卡介苗(Bacille Calmette-C,uCrin， BCG)株；成功构建膀胱肿瘤小鼠模型；证实重组BCG(rBCG-TRAIL)比常规 BCG等具有更强的抗膀胱肿瘤特性，毒副作用小。 二、主要研究内容 1．BCG穿梭表达载体的构建与鉴定：分别采用RT-PCR和PCR获取TRAIL和 A985B信号肽基因序列后，利用DNA重组技术将以上两个片段先后插入穿 梭质粒pMV261的HSP60启动子下游，构建分泌型BCG穿梭表达载体 pMV261-A985B-TRAIL并转化大肠杆菌、抽提和纯化， 对 pMV261-A985B·TRAIL进行酶切、PCR扩增及DNA测序鉴定。 2．rBCG-TRAIL的构建：利用电穿孔技术将pMV261-A985B．TRAIL导入BCG 构建rBCG-TRAIL，大量制各rBCG-TRAIL，分别用PCR扩增和Western blotting检测rBCG-TRAIL菌体和培养上清中TRAIL的DNA和蛋白表达， 用酶联免疫吸附法(ELIsA)检测rBCG培养上清中TRAIL蛋白的含量。 3．rBCG-TRAIL免疫治疗的研究：建立BTT739荷瘤小鼠膀胱肿瘤模型，观察 rBCG-TRAIL对膀胱肿瘤的免疫治疗作用。 三、结果 ’浙江省自然科学基金人才项Itl(项目号：303759) l 浙扛大学博士学位论文—摘要¨TRAIL基因重组卡介苗的构建及对膀胱肿瘤杀伤作用的研究I．经酶切、PCR和DNA测序鉴定；证实所克隆的信号肽AgSSB片段和TRAIL 浙扛大学博士学位论文—摘要¨TRAIL基因重组卡介苗的构建及对膀胱肿瘤杀伤作用的研究 I．经酶切、PCR和DNA测序鉴定；证实所克隆的信号肽AgSSB片段和TRAIL 片段与文献结果完全一致，pMV261-A985B-TRAIL的序列完全正确，连接方 向正确，阅读框与预期完全一致。 2．利用电穿孔技术成功构建rBCG-TRAIL：以rBCG．TRAIL质粒DNA为模板， 通过PCR扩增得到TRAIL的基因片段；Western印迹证实rBCG分泌的蛋自 能与TRAIL的抗体特异性结合，ELISA法检测到rBCG-TRAIL培养上清中高 含量的TRAIL蛋白(638．61pg／m1)． 3．成功构建BrIu739膀胱肿瘤小鼠模型。 4．rBCG-TRAIL对膀胱肿瘤小鼠的免疫治疗作用：rBCG-TRAIL治疗组的荷瘤 鼠平均肿瘤重量和平均体积均显著低于BCG+TRAIL、BCG、TRAIL治疗组 和PBS对照组；生存期显著长于BCG+TRAIL、BCG、TRAIL治疗组和PBS 对照组。rBCG-TRAIL治疗后的膀胱肿瘤，光镜下有明显的炎性细胞浸润、 肿瘤细胞坏死、出血等。 四、结论 1．成功构建了BCG穿梭表达载体pMV261·A邸5B-TRAIL。 2．利用电穿孔技术成功构建分泌TRAIL的rBCO-TRAIL，并在培养液中获得高 效、稳定的表达。 3．成功建立了BTT739荷瘤小鼠膀胱肿瘤模型。 4．rBCG-TRAIL比常规BCG等具有更强的抗膀胱癌特性，毒副作用小。 关键词：卡介苗；TRAIL；膀胱肿瘤；基因重组；免疫治疗 2 浙扛大学博士学位论文—擅要¨TRAIL基因重组卡介苗的构蔗及对膀臃肿瘤杀伤作用的研究Construction 浙扛大学博士学位论文—擅要¨TRAIL基因重组卡介苗的构蔗及对膀臃肿瘤杀伤作用的研究 Construction of Recombinant BCG Secreting TRAIL and Immunotherapeutic Effects on Bladder Cancer in Mouse Special ity Urofogy PHD．Candi date Shan-Wen Chen Tutor Prof．Zhou一．Tun Shen ABSTRACT OBJECTIVE To construct recombinant BCG secreting TRAIL and investigate the immunotherapeufic effects on bladder cancer in m