产紫杉醇菌株原生质体诱变育种及其生物合成调控的研究预防兽医学专业论文.docxVIP

2、向S．7发酵培养基添加适当浓度的前体物、代谢旁路抑制 2、向S．7发酵培养基添加适当浓度的前体物、代谢旁路抑制 剂和诱导子对微生物发酵法生产紫杉醇的合成代谢进行综合调 控可以大大提高紫杉醇的产量； 3、采用试验得出的最佳发酵培养条件，以筛选出的优化培养 基作为发酵培养基，菌株UV。。m发酵液中紫杉醇含量为 493．74pg／L，是改良s，7发酵培养基的1．25倍； 4、Nodulisporium sylviforme紫杉醇产生菌UV40．19原生质体制 备及再生的最佳条件为：每250mg湿菌丝体加酶液lmL(O．7mol／L NaCI配制由3％溶壁酶+3％纤维素酶+4％蜗牛酶+1％的溶菌酶组 成的复合酶系，pH5．5～6．O)一30℃振荡酶解5h一酶解液用三层 无菌镜头纸过滤*3000r／min离心10min，收集原生质体；将获得 的原生质体在含NaCl：KCl：葡萄糖(5：3：2，v／v／v，终浓度均 为0．7mol／L)的PDA再生培养基上，采用双层平板培养法再生制 备到的原生质体； 5、Nodulisporium sylviforme紫杉醇产生菌UV40．19原生质体诱 变的适宜条件为：将原生质体悬液经过0．8mg／mL NTG、处理 15min后，在电磁搅拌下，用紫外灯(30w，距离30cm)照射处 理40s： 6、在潮霉素含量为901xg／mL的抗性平皿中筛选出了一株高产 紫杉醇的原生质体诱变菌株一UNo”，其产量从出发菌株紫杉醇 的产量(376．384-8．41)pg／L提高至(478．120-11．36)Ixg／L； 7、探索出了一种新的、快速而高效的树状多节孢紫杉醇产生 菌基因组DNA的提取方法； 8、通过同工酶技术、RAPD、AFLP和ITS序列分析表明， 出发菌株与诱变菌株之间以及两诱变菌株之间都存在明显差异， 为进一步研究与紫杉醇生物合成相关基因及诱变株产量提高的 分子机制奠定了基础； 9、从东北红豆杉(Taxus cuspidata)树叶中获得了紫杉二烯 合成酶基因片段克隆，用GenBank(http／／www．ncbi．nlm．nih．gov) 合成酶基因片段克隆，用GenBank(http／／www．ncbi．nlm．nih．gov) 中的Blast程序对此个序列与GenBank中收录的序列进行了同源 性比较，同源性达到98％； Io、首次证实了紫杉二烯合成酶基因也存在于紫杉醇产生菌 ——树状多节孢Nodulisporium sylviforind这类丝状半知菌中，这 预示紫杉二烯合成酶也存在于通过微生物发酵法生产紫杉醇的 生物合成途径中。 关键词紫杉醇；紫杉醇产生菌；发酵；培养基优化；原生质 体诱变；遗传差异；Southern杂交 AbstractNowadays，tumors Abstract Nowadays，tumors and cancers seriously threaten human’s life， and they are one of the persistent ailments．For the human being，it is the second main cause of death that is just after heart and brain blood vessel diseases．For a long time，scholars made many attempts and explorations to prevent and cure all kinds of cancers in the world，but their results were dissatisfactory．Now，it is believed that the taxol is a new kind of anti—cancer drug，and it is very effective for many kinds of cancers．Therefore，the production of taxol becomes a hotspot in the field of research and exploitation of taxol around the world．Compared with other methods of producing taxol， the advantage of using microbiological fermentation to produce taxot is much more superior．In this experiment，the fermentation of taxol—producing fungu