当归红芪超滤膜提取物对过氧化氢诱导心肌细胞氧化损伤的保护作用中西医结合内科临床专业论文.docxVIP

兰州大学博士学位论文通过干预心肌细胞凋亡能在一定程度上保护心肌细胞，因此，人们在研究药物对心肌 兰州大学博士学位论文 通过干预心肌细胞凋亡能在一定程度上保护心肌细胞，因此，人们在研究药物对心肌 细胞凋亡影响方面产生了浓厚的兴趣。长期以来，中药在心血管疾病的治疗中占据了一定 的地位。目前，中药与心肌细胞凋亡相关性的研究正受到普遍关注，并取得了一些可喜的 成果，其研究正在不断深入，尤其在探索中药有效单体成分对心肌细胞凋亡的影响方面。 本实验室运用超滤膜技术对传统方剂当归补血汤进行分离纯化，前期研究已证实，当 归红芪超滤膜提取物具有清除氧自由基，抗脂质过氧化，抗心肌细胞凋亡的作用。在本课 题中，通过模拟体内心肌细胞氧化损伤过程，建立H202诱导体外培养心肌细胞凋亡模型， 观察当归红芪超滤膜提取物对氧化损伤诱导的体外培养心肌细胞凋亡的影响，从而为明确 当归红芪超滤膜提取物抗凋亡的作用机制及其临床应用价值奠定基础。 二、目的 l、运用超滤膜技术对中药合剂进行分离、纯化。 2、研究当归红芪超滤膜提取物抗心肌细胞氧化损伤的作用。 3、研究当归红芪超滤膜提取物抗心肌细胞凋亡的作用。 4、研究当归红芪超滤膜提取物对氧应激状态下心肌细胞热休克蛋白70表达的影响。 5、为当归红芪超滤膜提取物的临床应用提供实验依据。 三、方法 l、应用陶瓷膜微滤和聚丙烯腈(P!心)中空纤维超滤膜(截留分子量为10万分子量) 精制当归、红芪合剂(1：5)水提物。 2、Wistar乳鼠心肌细胞原代培养：取出生后卜3d的大鼠乳鼠，用75％乙醇溶液浸泡消 毒皮肤后，移入超净工作台。开胸取出心室肌，运用酶消化法反复多次消化，收集细胞悬 液，以差速贴壁法分离纯化心肌细胞，用含15％小牛血清的DF培养液调整细胞浓度至每毫 升5×105，在37℃、5％C02条件下培养。选生长状态佳者于72 h后进行实验。采用台盼蓝 染色法检汉口心肌细胞存活率。采用心肌细胞Ot横纹肌肌动蛋白(a-Sarcomericactin)的免疫 细胞化学染色方法鉴定心肌细胞纯度。 3、制备乳鼠心肌细胞氧化应激性损伤模型：以4001xmol·Ld的H202诱导心肌细胞凋亡。 实验分为以下5组：正常对照组；H202模型组(作用6h)；当归红芪超滤膜提取物高剂量 干预组(15 g·L．1)、当归红芪超滤膜提取物中剂量(7．5 g·L．1)干预组、当归红芪超滤膜提 取物低剂量(3．75 gL。1)干预组。倒置相差显微镜观察心肌细胞形态学改变：MTT法检测 心肌细胞细胞活力改变；Annexin V-FITC／PI双染法标记凋亡心肌细胞，采用流式细胞术检 测各组心肌细胞凋亡指数。 2 兰州大学博士学位论文4、应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和蛋白印(Western-blotting)技术测 兰州大学博士学位论文 4、应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和蛋白印(Western-blotting)技术测 定凋亡相关基因蛋白Hsp70、Caspase．3、Bcl．2、Bax的表达。 5、用生化学技术检测氧化应激状态下心肌细胞相关酶类如SOD、LDH、CK、MDA、 御O的变化。 四、结果 1、经紫外分光光度计测定，lo万分子量当归红芪超滤膜提取物(不含阿魏酸)多糖含 量接近单剂含量，当归多糖含量为23．84 g·L-1，红芪多糖含量为27．55 g·L．1，合剂多糖含量 为22．089·L．1 2、倒置相差光学显徼镜下观察：正常心肌细胞伸出伪足互相融合成片，细胞核折光性 好，搏动具有整体性、协调性和规律性(98．2-4：13．4次／min)。H202损伤组细胞皱缩，细胞 核暗淡，搏动明显减弱(20．14-3．3次／min)，部分停搏，搏动幅度强弱不一，搏动频率与正 常对照组相比较差异具有显著性(尸O．01)。当归红芪超滤物高、中、低剂量干预组心肌细 胞搏动频率分别为86．94-8．4、71．14-6．7和43．74-9．6次／min，细胞伪足较对照组变细，搏动频 率略减低，但高于氧化损伤组(尸0．01)。 3、MTT法检测心肌细胞的存活率：氧化损伤模型组心肌细胞严重受损，细胞存活率显 著降低(29．5％)，与正常对照组(89．7％)比较具有统计学意义(尸O．01)。当归红芪超滤物 干预组心肌细胞的受损显著改善，存活率显著提高，高、中、低剂量组分别为77．6％、64．4％、 43．996，与氧化损伤组比较差异显著(尸O．01)。 4、生化学检测：I-1202处理使细胞膜的通透性增加，培养介质中LDH(274．364-15．16U／L)、 CK(201．474-2．71 U／L)的含量增加，与正常对照组比较(LDH 138．07+11．27 U／L，CK42．694-1．53 U／L)，具有显著