假单胞菌lip35低温脂肪酶分离纯化及酶学性质研究发酵工程专业论文.docxVIP

摘要 摘要 低温脂肪酶是一类重要的水解酶，由于其具有低温高催化活性，耐有机溶剂以 及对热敏感等特点，在食品、洗涤、制药、脂类加工、低温环境修复等工业上有着 巨大的应用潜力，本论文建立了一套操作简单、快速且费用低廉的假单胞菌Lip35 低温脂肪酶的提纯方案，并系统研究了其酶学性质。 本论文以实验室保存的一株假单胞菌Lip35为出发菌株，采用10L发酵罐发酵 生产低温脂肪酶，离心得其粗酶液，然后经超滤浓缩、硫酸铵盐析、Sephadex G．25 脱盐、DEAE-纤维素离子交换层析及SephacryIⅢS．200凝胶层析进行分离纯化。实 验结果表明，通过控制离子交换层析和分子筛层析这两步的具体操作条件，大部分 杂蛋白被除去，所得的酶蛋白经PAGE电泳鉴定为单一条带，达到电泳纯。测得该 纯化酶的比活达到834．72 U／mg，比初始发酵液提高了26．02倍，酶蛋白得率达到 15．76％。 在获得纯化低温脂肪酶的基础上，对其酶学性质进行了系统研究。经SDS．PAGE 电泳测定，该低温脂肪酶的分子量为39．8 kDa，酶蛋白的最适催化温度为25℃，在 15～35℃范围内趋于稳定，能达到最大酶活的80％，对热敏感，60℃处理10rain， 酶活性仅残留10％；该酶最适作用pH值为8．1，在pH8．o~9．5范围内趋于平稳，属 于典型的低温碱性脂肪酶，该酶在较宽的pH范围内(6．啦9．0)稳定性较好，室温 处理24h后，酶活力能残留在80％以上，具有较好的pH耐受性。金属离子试验中 发现：大部分金属离子对该脂肪酶均有不同程度的抑制作用，其中尤以A13+、Zn2+、 Fe2+抑制作用最强，Ca2+g膏J-酶有显著的激活作用，可将酶活性提高两倍以上，但EDTA 的加入几乎使酶失活，初步判定该酶是金属离子依赖酶，SDS对酶蛋白的变性作用 抑制其酶活性。以p-NPP为底物用双倒数作图法测得Vmax为7．93 m mol／L．min， Km值为14．31mmol／L。 本论文对低温脂肪酶的提取、纯化及酶学性质做了基础性研究，为进一步研究 低温脂肪酶的催化机理，分子克隆以及工业化应用提供了一定的理论指导。 关键词：假单胞菌；低温脂肪酶；分离纯化；酶学性质 Purification Purification of cold-adapted Hpase from Pseudomonas Lip35 and Enzyme eharacterizations Author：．Xinxin Meng Supervisor：．Ymgmin Jia Major：．Fermentation Engineering (College ofFood Science and Technology,Agricultural University ofHebei) Abstlract Cold-adapted lipase is a kind of hydrolase that mainly applied in fields such as food, medicine,environment protecting ere．This research established a set of method which is easy,fast and inexpensive for ex仃a幽ng and purifying the cold-adapted lipase from Pseudomonas Lip35，and then studied the characterizations of p谳fied enzyme systematically． This experiment use a strain of Pseudomonas Lip35 which preserved in the laboratory as the fermentation strain to ferment cold-adapted lipase in the I OL fermentation tank．Cold—adapted lipase Was purified by using ultrafiltration，ammonium sulfate fraetionation，Sephadex G-25，DEAE—cellulose ion—exchange chromatography and Sephacryl 1MS一200 gel filtration．111e result indicated that by controlling the detail conditions of ion-exchange chromatography and