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研究内容(二)：构建可被荧光报告是否发生感受态的菌株。（cinA是S.pn感受态发生之后表达的蛋白基因，与外源基因的同源重组有关，因此将荧光蛋白基因接于其后，荧光表达可报告感受态的发生）1)???? 将绿色荧光蛋白（gfp）基因替代pEVP3质粒中的LacZ基因，得到荧光报告质粒。 2) 设计S.pn的cinA基因下游的PCR引物，构建含有cinA基因下游序列的荧光质粒(pEVP4)。将pEVP4质粒转化感受态缺陷和非缺陷的S.pn，得到转化菌株。 研究内容(三)：体外转化实验以验证感受态缺陷菌不能发生转化，且荧光表达的确可报告感受态的发生。 1)?做体外转化实验，验证所构建的菌株能被荧光表达报告感受态的发生，且感受态缺陷菌不能发生转化。 2)检测基因comC、D、E的表达情况，进一步佐证所构建的菌株为需要的菌株。 研究内容(四)：通过感受态缺陷和非缺陷菌的粘附实验及体内毒力实验分析细菌的感受态发生是否与其致病毒力相关。 1)??分别用感受态缺陷和非缺陷菌处理A549细胞,观察二者处理后细胞粘附的菌落的多少变化。 2)?分别将感受态缺陷和非缺陷菌注射入BALB/ct小鼠体内，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。 3) 分别将感受态缺陷和非缺陷菌滴入QS小鼠的鼻黏膜上，观察二者感染小鼠的致死率是否不同。 研究内容(五)：检测感受态缺陷及非缺陷菌基因comC、D、E在体外和体内的表达情况，以进一步验证细菌毒力的改变是否与其感受态的形成有关。 1)? 合成基因comC、D、E的探针，做northern blot。 2）制备基因comC、D、E蛋白的抗体，做western blot。 3、拟解决的关键问题： 存在问题：未能抓住关键问题或抓得不准。 撰写要求：找出关键问题，写出解决办法。 什么是关键问题 ？ --研究过程中对达预期目标有重要影响的 某些研究内容或因素。 --为达预期目标所必须掌握的关键技术或 研究手段。 4、研究方法 存在问题： 过于简单：在实验方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。 撰写要求：以研究项目的需求为前提，尽量采用目前 最先进的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体 现在技术路线当中。 5、技术路线 存在问题： 不清楚，不详细。 撰写要求： 清晰、详细、注意逻辑性。 撰写方法： 以时间顺序为主线设计技术路线 以研究内容为主线设计技术路线 分大小标题，突出逻辑关系。 详细地写清楚每个具体步骤。 6、可行性分析 理论分析 研究手段、方法分析 预实验结果分析 所用特殊实验材料（试剂）的分析 对所具备的实验条件进行分析 对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析 CP1250肺炎链球菌及质粒pEVP3由Morrison教授赠送，人肺癌上皮A549细胞已从中科院上海细胞所购得，流式细胞仪荧光记数测定在我校儿童医院完成，PCR引物由北京赛北盛生物有限公司合成。 研究发现，肺炎链球菌在感受态产生后可使一些蛋白表达，其中包括自溶素，这表明其感受态的产生与细菌毒力的改变相关，因此研究转化过程与细菌致病之间的关系是有事实基础的。 目前的研究表明肺炎链球菌的感受态形成都受到操纵子comCDE的调控，因此失活基因comC或comD或comE可使菌株不能产生感受态，已有通过失活这几种基因构建感受态缺陷菌株的文献报道。cinA为转化相关基因，因此用它为报告基因以确定肺炎链球菌在体内是否发生感受态，已有构建cinA-LacZ融合基因菌株的报道。 本实验室已掌握肺炎链球菌体外转化的方法，而粘附及毒力实验的方法已有多篇报道。因此本研究的技术路线从理论上讲是合理的，而方法是成熟的。 7、创新性 对创新的理解：创新性与先进性是有根本区别的。 原始创新： 填补空白或修改传统的理论； 新技术、新方法的发明创造。 跟踪创新： 在前人工作基础上补充、完善现有理论； 对原有技术、方法进行修改后产生1＋1＞2的 效果。 细菌在宿主体内是处于一个生存竞争的战场，其是否致病取决于机体内环境与细菌相互斗争、相互适应的结果。在体内寻找细菌毒力因子的表达是目前研究病原菌致病机理的热点。细菌致病机理已研究多年，由环