基于存在形式的人精浆游离mRNA和microRNA提取-妇产科学专业论文.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 II II 结果………………………………………………………………………48 讨论………………………………………………………………………51 参考文献…………………………………………………………………52 实验二 提取精浆游离 microRNA 的质量分析 前言………………………………………………………………………54 材料与方法………………………………………………………………55 结果………………………………………………………………………57 讨论………………………………………………………………………61 参考文献…………………………………………………………………63 实验小结………………………………………………………………… 64 综述……………………………………………………………………… 65 附录……………………………………………………………………… 73 致谢……………………………………………………………………… 74 PAGE 1 PAGE 1 中文摘要 第一部分 基于存在形式的人精浆游离 mRNA 提取 实验一 基于存在形式的人精浆游离 mRNA 提取方法 背 景 与 目 的 ： 本 小 组 在 前 期 研 究 中 ， 已 发 现 绝 大 部 分 精 浆 游 离 mRNA （cell-free seminal mRNA, cfs-mRNA）存在于精浆小体中，从而保护不被精 浆 RNA 酶降解。由于精浆小体直径大部分在 0.10μm 以上，本实验拟采用 0.10μm 滤膜对精浆标本微过滤（microfiltration, MF）截留大部分精浆小体，用于提取 cfs-mRNA，检测这种基于存在形式的提取方法的提取量，同时也是对 cfs-mRNA 的存在形式进行证实性研究。 方法：收集精液参数正常的男性精液标本，用 0.10μm 滤膜过滤后用 Trizol LS Reagent 提取 cfs-mRNA，通过荧光定量 RT-PCR，扩增管家基因β-actin（ACTB）、 睾丸组织特异基因 DDX4、PRM2、附睾特异性表达基因 WFDC9、前列腺特异基 因 TGM4、精囊腺特异基因 SERPINA5，与不过滤直接应用 Trizol LS Reagent 提 取 cfs-mRNA 比较，分析 0.10μm 滤膜对 cfs-mRNA 提取含量的影响。 结果：将正常男性精浆标本通过 0.10μm 滤膜后再采用 Trizol LS Reagent 提 取 cfs-mRNA，与未过滤提取的 mRNA 比较，分别有 93.9%±15.7%（Mean±SE） ACTB、99.1%±12.5% DDX4、76.9%±18.5% PRM2、88.1%±29.6% WFDC9、 150.2±73.6% TGM4、98.6%±17.8% SERPINA5 被提取，各基因水平均无明显降 低（P0.05, n=6, Paird-Samples t -test)。说明大部分含 cfs-mRNA 的精浆小体被 0.1μm 滤膜截留下来，滤膜上精浆小体内 cfs-mRNA 足以稳定被检测出。 结论：利用 0.10μm 滤膜对精浆小体进行富集，进而再提取 cfs-mRNA，这 种基于存在形式的提取方法，不会对 cfs-mRNA 量产生明显降低，因此可有效的 提取 cfs-mRNA。且本实验结果与前期课题组对通过精浆小体的获取及过滤实验 等结果一致，表明大部分精浆小体不能通过 0.10μm 滤膜，同时证实 cfs-mRNA 主要被包裹在精浆小体中。 关键词：精浆小体；游离 mRNA；滤膜；精浆 实验二 提取精浆 mRNA 的质量分析 背景与目的：以上实验表明，基于存在形式的提取所获得的 cfs-mRNA 产量 无明显损失，且操作简便，具有可行性。另一方面，精浆成分复杂，经滤膜过滤 后，应可以避免一些成分对提取 RNA 的影响，而提高 RNA 的质量。本部分实 验主要分析经滤膜过滤后所提取的 cfs-mRNA 的纯度和 DNA 污染等。 方 法 ： 分 别 通 过 未 过 滤 直 接 用 Trizol LS Reagent 提 取 方 法 ， 和 微 过 滤 （microfiltration, MF, 直径 0.1μm）后 Trizol LS Reagent 对留于滤膜上的精浆小 体进行裂解提取的方法，提取 cfs-mRNA。通过分光光度计测定两种方法提取的 mRNA 纯度（OD260/280）；通过毛细血管电泳对所提取的 RNA 片段分布进行分 析；荧光定量 PCR 扩增 DDX4，定量检测两种方法提取的 cfs-mRNA