碱性蛋白酶产生条件和酶学性质及其基因克隆的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

III III I I II 1[I II I I IIII III Y1 833876 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位做懈敬荔丝 吼舫s删日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：教蓊豇 同期：刀解岁月歹／同 摘要摘要 摘要 摘要 以本实验室保存的枯草芽孢杆菌115为材料，通过单因子实验法优化了其发 酵产碱性蛋白酶的培养基和发酵条件，福林法测定酶活性，并研究了碱性蛋白 酶的部分酶学性质。研究结果显示：玉米淀粉1．2％和豆饼粉O．3％可作为最适经 济碳氮源。培养基初始pH 8．0，37℃，16 h达到最大产酶量3384U／mL；碱性蛋 白酶的最适反应pH和温度分别是pH 8．0和65℃，该酶具有较好的pH和热稳定 性，pH 11时仍有最大酶活性的90％，在pH 7～11保存24 h仍然能保持至少82％ 的酶活。40．50℃保存3 h，酶活性几乎没下降。70℃条件下半衰期为2．5 h。Ca+ 能有效激活酶活力，PMSF几乎完全抑制酶活性，推测该酶应属于丝氨酸碱性蛋 白酶，该酶对表面活性剂和温和型去垢剂具有超强的耐受性。 另外，我们用PCR法从枯草芽孢杆菌115总DNA中克隆了碱性蛋白酶基因 (sap)，基因在GenBank中的登录号为GQ339614．1。比对了碱性蛋白酶和其他 已经报道的丝氨酸碱性蛋白酶的氨基酸序列，结果表明其同源性达到99％，证 实了我们之前的推测：该碱性蛋白酶属于丝氨酸碱性蛋白酶。然后我们利用网 络资源对该酶的信号肽进行了预测。结果显示，前29个氨基酸是该酶的信号肽。 同时我们还成功构建了表达载体pET-25b．sap，但将诱导后的宿主菌BL 21的培 养液点在脱脂奶粉平板上未见蛋白酶活性，培养液上清中也未见蛋白酶活性。 关键词：优化；碱性蛋白酶；酶学性质；克隆 AbstractAbstract Abstract Abstract Medium composition and culture conditions for the alkaline protease production by Bacillus subtilis I 1 5 were optimized，with mono—factor experiment．The activity of alkaline protease is determined by Folin phenol method．Effect of different factors and parameters on protease production revealed that the maximum secretion(3384 U／mL)loccurred as follows：corn starch 1．2％as carbon source，soybearl cake powder0．3％as nitrogen source，pH 8．0，fermentation temperature 37*(2，fermentation time l 6 h．Proteolytic activity of the culture supernatant showed maximum activity at 65℃and pH 8．0．The enzyme showed good thermostability and pH stability．The protease activity‘Was stable over a pH range from 7．0 to l 1．0，retaining more than 82％of its activity after 24 h of incubation at 25C and high activity Was detected after incubation of the culture supernatant a