碱性蛋白酶高产菌株的选育与酶学性质研究-微生物学专业论文.docxVIP

摘要摘要 摘要 摘要 碱性蛋白酶是一类在生理上、商业上非常重要的酶类。现己广泛应用于洗涤剂、制 革及丝绸工业，在医药、食品、环保、银回收、基础研究等领域显示了广阔的应用前景。 因此，不断提高碱性蛋白酶生产菌株的发酵活力，大力开展碱性蛋白酶的相关研究有着 非常重要的意义。利用复合诱变原生质体技术选育工业新菌种，是一种行之有效的方法， 近年来受到国内外普遍重视。 本实验出发菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus lichen折orm)S23，其碱性蛋白酶活力为 20387 u／mL。本文采用原生质体复合诱变进行菌种选育，并对发酵条件、酶的纯化方法 和酶学性质进行了研究。主要研究内容如下： 1．研究了青霉素、溶菌酶、甘氨酸和渗透压稳定剂等因素对原生质体形成和再生 的影响，得出原生质体形成及再生最佳条件为：甘氨酸1mg／mL，青霉素0．4u／mL，加 入时间为对数生长中期；溶菌酶添加量2mg／mL，作用温度37。C，作用时间6h；稳定剂 为琥珀酸钠，再生培养方法为平板双层法。原生质体形成率和再生率分别达到93．8％和 37．5％。 2．研究了原生质体紫外线单因素诱变和UV-EMS复合诱变，最佳实验条件：紫外 线单因素处理剂量为3min：紫外线UV-EMS复合诱变剂量为uV照射1min，EMS浓度 为30mg／mL；孢子加热选育实验条件为温度80。C，处理时间20rain，7％葡萄糖肉汤培 养基交替处理。经多次诱变选育，从大量突变株中筛选到一株稳定高产的碱性蛋白酶产 生菌SH一59，其活力达到32356,u／mL。 3．对高产菌株SH．59进一步进行了发酵培养基的优化实验，分别研究了碳源、氮 源、各种无机盐、培养基起始pH对产酶的影响，并采用正交实验方法，探索了培养基 各组成成分对发酵产酶的影响。确定最佳培养基(％)为：玉米粉6．5，豆饼粉4．0，KH2P04 0．04，Na2HP04 O|3，CaCl2 0．4，pH9．0。同时对摇瓶发酵工艺进行了研究，分别试验了种 龄、接种量和装液量对产酶的影响，绘制了发酵过程曲线。确定最适发酵条件为：种龄 12h，接种量2％，装液量25ml／250ml，摇床转速210r／rain，培养温度37。C，发酵周期 44h。酶活达到38925 la／mL。 摘 摘 要 4，对高产菌株SH一59碱性蛋白酶纯化方法进行了研究。发酵液经硫酸铵分级盐析 获得粗酶，再由DEAE．Sephadex．A一50及CM．Sephadex．C一50层析等方法对酶进行了纯 化，SDS—PAGE表明纯化后的样品己达到电泳纯，分子量为28kDa。 5．对酶的性质进行了研究。当以酪蛋白为底物时，该酶的最适pH为10．0，最适 温度为55。C。此外，该酶在pH7—11的范围内稳定，在50。C以下有较好的热稳定性，对 1 mol／LH202具有一定的耐氧化性。 关键词地衣芽孢杆菌；原生质体；碱性蛋白酶；发酵条件；性质 I】 AbstractAbstract Abstract Abstract Alkaline proteases physiologically and commercially important group of enzymes It has been applied universally to industrial of detergents，leather processing and silk．Besides， it has wonderful prospect of application potential in medical purpose，food processing， silver recovery and environment protection，as well as basic research．Therefore，it is important to improve the enzyme activity of the strains of producing alkaline protease continuously．The complex mutagenefic treatments 011 protoplasts are a kind of effective method to get high—output strains． Taking Bacillus licheniformis$23 as the initial strain，its enzyme activity is 203879／mL． ‘llae complex mutagenetic treatments on protoplasts were used in this study．The fermenta