椒样薄荷病毒种类的分子鉴定及检测研究-植物病理学专业论文.docxVIP

The Molecular Identification and Detection of Peppermint Viruses A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Hao xiao-Jun (Plant Pathology) Dissertation Supervisor: Prof. Huang Jia-feng Jun，2012 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的 研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表 示谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于赢利目 的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 I I 摘 要 椒样薄荷是新疆的一种香料植物，随着种植年限的增加，椒样薄荷精油品质和产量 逐渐下降。本实验对椒样薄荷病毒进行了分子鉴定，并建立相应的检测方法，为椒样薄 荷无毒化栽培及生产提供理论基础。 从田间采集表现明显病毒症状的椒样薄荷病株，采用纤维素（CF-11）层析方法， 对椒样薄荷植株中的病毒 dsRNA 进行分离，利用改进的单引物法扩增到一段约 400 bp 产物，然后对其进行克隆与测序。得到该片段核苷酸序列为 352 bp，序列分析表明为 黄瓜花叶病毒（CMV）1a 基因的部分序列，与其它已报道 CMV 1a 基因序列同源性高 达 96%。 根据所获病毒信息，设计了 3 对针对 CMV 2a 基因、2b 基因和 CP 基因特异性 引物，对病株进行了相应目标基因的 RT-PCR，结果均扩增到预期的目标片段。利用间 接 ELISA 从 186 个 样 品 中 检 测 出 3 个样品呈 阳 性 。 并 利 用 免 疫 反 转 录 PCR （IC-RT-PCR）从分离物 MP1 中检测到 CMV，通过体系优化，建立了针对 CMV 的 IC-RT-PCR 检测体系，该体系病毒粗提液的稀释限点为 10-6。 根据 CMV RNA3 基因组全长设计特异引物从分离物 MP1 中扩增到目标片段，将 其进行克隆和测序，得到 2189 个核苷酸，序列分析表明，该序列与其它已报道 CMV RNA3 组分核苷酸序列同源性达到 90% 以上；包含 2 个分别编码 3a 基因和 CP 基 因的开放阅读框。3a 基因为 838 个核苷酸，编码一个由 279 个氨基酸组成的蛋白质 （分子量为 30.6 kDa），与其它已报道 CMV 的 RNA 核苷酸同源性为 93.4%～96.9%， 氨基酸同源性为 95.4%～99.1%。CP 基因为 657 个核苷酸，编码一个由 218 个氨基酸 组成的蛋白质（分子量为 24 kDa），与其它已报道 CMV 的 RNA 核苷酸同源性为 93.9%～96.8%，氨基酸同源性为 97.7%～99.1%。基于 CMV 基因组 RNA3 上的 3a 基 因和 CP 基因构建系统关系树，来自伊犁椒样薄荷的 CMV 与来自福建的 PE 分离物 关系最近，位于同一个进化分支。 关键词：椒样薄荷；双链 RNA；分子鉴定；检测；黄瓜花叶病毒 II II II II Abstract The peppermint (Mentha piperita. L) is one of important aromatic crop in Xinjiang. In recent years, the the quality and yield of peppermint essential oil has decreased gradually. In this study, virus species from peppermint was identified by molecular technique, and method for detecting virus infection was established. Field s