降血压肽VLPVP降血压活性和吸收机理的研究-营养与食品卫生学专业论文.docxVIP

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 缩写词 英文全称 缩略词 Angiotensin Converting Enzyme ACE Apical AP Basolateral BL Antihypertension AHP Dulbecco’s modified eagle’s medium DMEM Epithelial voltohmmeters EVOM Fetal bovine serum FBS hippuric acid Hip High performance liquid chromatography HPLC hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid HEPES Methyl thiazolyl tetrazolium MTT Multidrug resistance protein 2 MRP2 N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate HHL Non-essential amino acid NEAA P-glycoprotein P-gp spontaneously hypertensive rat SHR the human colon carcinoma cell lines Caco-2 Transepithelial electrical resistance values TEER Val-Leu-Pro-Val-Pro VLPVP 1 华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE PAGE 1 降血压肽 VLPVP 降血压活性和吸收机理的研究 硕士研究生： 雷林 导师： 刘烈刚教授 李世敏教授 摘 要 目的 检测基因工程表达生产的降血压肽 Val-Leu-Pro-Val-Pro （VLPVP）的降血压活 性，建立其高效液相色谱（HPLC）检测方法，并对其吸收机理进行研究，为其进入 实际应用提供理论基础。 方法 1） ACE 能催化 HHL 分解产生马尿酸，而降血压肽通过抑制 ACE 的活性降低 马尿酸的产量，采用反向 HPLC 测定马尿酸在 228 nm 处的吸收，以此计算目的多肽 体外活性； 2） 通过测量口服降血压肽后 SHR 老鼠血压的变化确定 VLPVP 的体内降血压活 性； 3） 利用安捷伦 1100 液相色谱仪和 VYDAC 238EV54 C18 反向色谱柱确定降血 压肽 VLPVP 的液相检测方法； 4） 采用 MTT 比色法研究 VLPVP 对 Caco-2 细胞的毒性； 5） 通过观察 Caco-2 细胞单分子层的形态，细胞极性研究、标志物渗漏检测和 跨膜电阻（TEER）来判断模型是否成功建立； 6） 采用 Caco-2 细胞模型来研究 VLPVP 的细胞吸收转运动力学。考察了 pH、 浓度、ATP 能量抑制剂、竞争性转运载体抑制剂、表面活性剂、P-gp 抑制剂、MRP1 和 MRP2 抑制剂以及细胞内吞抑制剂等对 VLPVP 的转运吸收和分泌的影响。 结果 1）建立 HPLC 法测定 VLPVP 的色谱条件如下，色谱柱：VYDAC 238EV54 C18 （200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈:水（22:78），0.05%TFA；流速：1.0 mL/min； 检测波长：202nm；柱温：30℃；灵敏度：0.01AUFS；进样量：20μL。日内、日间 精密度 RSD%均在 2%以下，准确度均在 99%以上。VLPVP 在室温以下及 6.0-8.0 的 pH 下贮存相对稳定，可贮存 30 d。反复冻融 3 次对其稳定性无影响。 2）研究了降血压肽 VLPVP 的体内体外降血压活性，其体外对血管紧张素转化酶 的抑制活性（IC50）为 1.8 μM。 3）以 800 μg/kg·bw 剂量口服给药高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat）2 h 后，降压幅度达到 40.9±15.7 mmHg，与空白对照组比较血压降低显著（P0.01）， 以 400 μg/kg·bw 剂量口服给药高血压大鼠（spontaneously hypertensive rat）2 h 后， 降压幅度达到 28.3±23.0 mmHg 与空白对照组比较血压降低显著（P0.05），较卡托 普利对照组（10 mg/kg·bw）相当，其降血压活性可以持续 12 h 以上，而且对正常大 鼠的血压无显著的降血压作用。 4） 采用 MTT 比色法研究 VLPVP 对 Caco-2 细胞的毒性。实验结果表明，小于 14 mmo/L 的 VLPVP 溶液对细胞没有毒性；而大于 14 mmo/L 的 VLPVP 溶液对细胞 呈现毒性。 5）在本实验