胶质母细胞瘤中抑制EZH2的表达改善替莫唑胺化疗敏感性的研究-神经外科学专业论文.docxVIP

博士学位论文的条件为：940C 博士学位论文 的条件为：940C 4分钟，94。C 1分钟40个循环，560C 1分钟，and 72。C 1分钟。 PCR引物：EZH2 forward，5-GCC AGA CTG GGA AGA丸虹CTG．3’reverse， 5-TGT GCT GGAAAATCCAAG TCA．3’；内源性参照物D-actin forward，5-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3’and reverse，5-ATC TTC AAA CCT CAT GAT G．3’。 MTT试验 通过MTT试验来检测细胞活力。在96孔板上放置5x104细胞IIL，加入 替莫唑胺(200 pg／rra)培养24，48，72，96和120小时。经过3天的培养，每孔加 入20 pl的MTT溶液(5 mg／ml；Sigma)培养4小时，然后移去MTT溶液，加 入200山二甲基亚砜(DMSO；Sigma)来溶解晶体。通过570nm波长的光密度 仪检测。 免疫印迹试验 培养的细胞裂解：裂解液RIPA(O．1％SDS，1％TritonX-100、1 mM MgCl 2、10 mM Tris-HCl，pH 7．4)40C 30分钟，收集裂解液并离心，测定蛋白质浓 度。全细胞裂解液(50斗G)使用十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS．PAGE)分离。将蛋白质转到硝酸纤维素膜上。非特异性结合位点使用 5％脱脂奶粉TBST溶液(100 mM Tris．HCl，pH值7．5，150 mM氯化钠，O．1％ Tween 20)封闭，使用抗ezh2和抗GAPDH抗体室温孵育2小时。用TBST洗 涤4次后，将膜用羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗孵育(西格玛奥德里奇， 圣路易斯，MO)5％脱脂奶粉TBST溶液在室温下反应1小时；采用增强化学 发光法显影(Perkin-Elmer Life Sciences，Boston，MA，USA)。 SiRNA转染 EZH2和siRNAs由上海吉玛制药合成(上海，中国)。抗EZH2靶序列及 对照序列：5-GAC UCU GAA UGCAGU UGC UTT-3’和5-AGC AAC UGC AUU CAGAGU CTT-3’。细胞接种于6孔板中生长在含血清和无抗生素的培养 基。转染细胞达到60％融合时，用脂质体2000(Invitrogen)根据制造商的说明 III 万方数据 摘要进行转染。转染后4-6小时后细胞使用常规培养液冲洗，48小时后测试抑制的 摘要 进行转染。转染后4-6小时后细胞使用常规培养液冲洗，48小时后测试抑制的 效率。 流式细胞仪分析 按上面描述的转染48小时后，收集细胞，PBS洗两次。洗过的细胞于O．6“ PBS重悬，用1．4毫升加100％乙醇溶液固定在40C过夜。固定细胞用PBS洗 两次，并用碘化丙啶(PI)溶液重悬，PBS溶液包括50 ug／mL的PI和50 ug／ml RNase A(Sigma)没有钙和镁，并分别在370C遮光孵育30分钟。染色后的细 胞通过尼龙网筛除去细胞团块，用流式细胞仪和Cell Quest软件分析(Becton Dickinson,San Jose，CA，USA)。流式细胞仪重复分析3次。 统计学分析 数据使用均数4-标准差(SD)表示，使用Smdents-Newman-Keuls方法比较， P0．05认为有统计学意义。 结果 和母系U251及U87细胞系相比，EZH2在U251／TMZ和U87，TMZ中的表达 增加。 我们检测了U251／TMZ细胞、U87／TMZ细胞及母系U251及U87细胞系 的生长活力。结果表明，与U251及U87相比U251／TMZ和U87／TMZ细胞约 5倍耐TMZ。我们还检测了EZH2在胶质母细胞瘤细胞和TMZ诱导耐药细胞 的蛋白表达。结果表明：在U251／TMZ和U87／TMZ细胞比在母系胶质母细胞 瘤细胞EZH2的表达水平更高，提示EZH2可能与胶质母细胞瘤细胞的耐药机 制有关。 EZI-12 siRNA能逆转U251／TMZ和U87／TMZ对替莫唑胺的耐药性。 为了确定EZH2在胶质母细胞瘤对替莫唑胺耐药机制中是否起着关键的作 用，我们将U251／TMZ和U87／TMZ细胞转染EZH2 siRNA和对照siRNA。转 染的效率使用定量RT-PCR证实。Western blot结果表明EZH2 siRNA可有效降 IV 万方数据 博士学位论文 博士学位论文 低EZH2蛋白水平。MTT试验显示敲除EZH2可以显著降低U251／TMZ和U87 ／TMZ细胞大约30．40％的活力，提示EZH2可能调节U25 1／TMZ和U87／TMZ 细胞对替莫唑胺的耐药性。 EZI-12 siRNA转染的U25