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胶原/
胶原/乳酸-己内酯共聚物双层管状支架的制备及其组织再生
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胶原/乳酸-己内酯共聚物双层管状支架的制备及其组织再生
摘 要
现在,纳米生物材料正处于迅猛发展的时期。静电纺丝技术是制 备纳米生物材料的有效方法,正在吸引越来越多研究者的关注。静电 纺纳米纤维膜的结构类似于细胞外基质的结构,这种结构有利于细胞 在上面的粘附和增殖。但是,静电纺纳米纤维膜不适合细胞的三维长 入,在应用于病损组织修复时存在一定的局限性。把纳米纤维加捻在 一起可以得到纳米纱,纳米纱的表面具有纳米纤维膜的结构特征,可 以仿生细胞外基质。把纳米纱加工成膜,就可得到具有较大孔径和较 大孔隙率的纳米纱支架。这种支架的孔隙率比纳米纤维膜的要大一 些,孔径的大小和细胞直径在同一数量级。纳米纱支架上的孔是由纤 维之间的沟壑形成的,这些孔几乎都是连续的,从而能使细胞在支架 内部深度渗入。
本研究中,我们首先通过传统静电纺丝工艺,制备了 P(LLA-CL) 纳米纤维支架和胶原蛋白(COL)含量不同的 COL/P(LLA-CL)纳米纤 维支架,研究了它们的基本性能,发现胶原蛋白的加入会降低纤维的 直径和支架的力学性能;当胶原蛋白含量为 25%时,支架表现出了一 定的亲水性。通过动态流体静电纺丝工艺,我们制备得到了平行排列 的 P(LLA-CL)纳米纱支架(NYS-P)和 COL/P(LLA-CL)纳米纱支架
(NYS-CP)。两者都是由较粗的纤维构成,纤维和纤维之间存在沟
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壑。不同的是,含有胶原蛋白的 NYS-CP 支架的单根纤维上,可以看
到较多的向外延伸的纳米纤维,这种特殊的结构,可以较好地仿生细 胞外基质,有利于细胞的粘附。结合前期的研究,我们采用传统静电 纺丝工艺和动态流体静电纺丝工艺,使用胶原蛋白含量为 25%的 COL/P(LLA-CL)共混物制备出了内径为 4mm 左右的双层管状支架
(BLTS),这种支架的外层是疏松的纳米纱层;内层是致密的纳米 纤维层。用 SEM 观察支架的横截面,发现内外层的分界面比较清晰, 两者结合得也比较紧密。力学性能测试结果显示,管状支架结合了内 外层的各自特点,表现出了良好的力学性能。
体外生物相容性测试以猪髋内皮细胞(PIEC)和小鼠成纤维细 胞(L929)为种子细胞。MTT 结果表明,胶原蛋白的加入可以增加 支架的生物相容性;细胞在纳米纱支架上的增殖速度比在纳米纤维支 架上的要快一些,这是因为纳米纱支架具有较大的孔隙率,能提供给 细胞更大的生长空间。细胞粘附实验和生长形态的观测结果表明,内 皮细胞经过 6 个小时就可以粘附到 COL/P(LLA-CL)纳米纤维支架上; 经过 24 个小时,细胞就能完全在支架上伸长开,表现出了良好的生
长形态;经过 4 天,细胞已经互相长在了一起,形成了内皮组织类似
物;经过 7 天,内皮细胞长成了一厚厚的组织。兔子体内生物相容性 实验结果表明,纳米纱支架的大孔结构很适合细胞的深度长入和组织 的再生。
我们从大鼠活体中分离得到了气管上皮细胞和软骨细胞,然后将 两种细胞先后种植在 BLTS 支架上,放置于细胞培养箱里培养 7 天,
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发现 BLTS 支架的外表面生成了软骨类似物。把种有细胞的 BLTS 支
架包埋于健康 SD 大鼠的气管筋膜内 2 周,进行预血管化处理。然后 把预血管化的 BLTS 支架、只种有细胞的 BLTS 支架、未经任何处理 的 BLTS 支架原位移植到了大鼠体内的气管缺损。HE 切片结果表明: 细胞均可以长入到各组 BLTS 支架的纳米纱层,且经过预血管化处理 的 BLTS 支架更有利于组织的再生,还可以使支架保持较好地形状。 流式细胞检测结果表明:经预血管化处理的 BLTS 支架在大鼠体内的 免疫原性明显降低。CK 免疫荧光和特殊染色实验表明:上皮细胞在 经预血管化处理的 BLTS 支架上的生存状态较好,合成了上皮角蛋白 抗原 CK,预血管化处理后的支架更有利于组织再生。
关键词:乳酸-己内酯共聚物;纳米纱;多孔结构;双层管状支架; 组织工程再生
FABRICATION OF COLLAGEN/P (LLA-CL) BI-LAYER TUBUL
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