豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的分离及转化芥菜的研究-蔬菜学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 本实验是利用植物基因工程获得抗虫的转基因芥菜植株，结果如下： 1．豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的分离： 分别提取豇豆种子、子叶及叶片的总RNA，逆转录成cDNA。以豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 两端的序列为引物，用RT-PCR的热启动方法从上述cDNA中扩增Hi目的基因片断·广—～ 2．PCR产物的克隆： 倮用A／T克隆法，将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后用T‘连接酶与pUCm—T载体连 接，构建成克隆载体pUC-Cp，转化大肠杆菌DH+。，挑选白色重组子菌落进行PCR扩增及酶切 验证。∥ 3．克隆片断的序列测定与分析： 觚选有插入片断的重组子单菌落，委托大连宝生物工程公司测序。结果表明：所克隆的 目的片断为326bp，编码108个氨基酸。经网上同源性比较，核苷酸的同源性为99％．所推导 的氨基酸的同源性为80％，1‘ 4．中间载体及表达载体的构建j 隅pUcIcp质粒和pGEM一7z质粒．用Kpnl和BamHl酶切，分别回收CpTI片断和酶切后的 载体片段，用L连接酶连接构建成中间载体pGEM—Cp。经酶切和PCR扩增验证后，以Xbal和 SacI双酶切pGEM-Cp和pBll21，将切下的CpTI片段和pBll21载体片段连接构建成表达载体 pBll21—cp，用冻融法导入农杆菌LBA4404，提取质粒，经PCR扩增检测，用于芥菜的遗传转 化。广Ⅶ 5．芥菜高频再生体系的建立： 似4天左右的叶用和茎用芥菜子时、下胚轴和25天苗龄的芥菜无菌苗的叶片为外植体。 以惦为基本培养基。通过加入不同浓度和不同组合的BA、NAA、KT，筛选到了外植体不定芽 分化的最适培养基(MS+BA3．Omg／L+NAAO．Img／L)及生根的最适培养基(MS+NAAO．2mg／L)．三 种外植体中，子叶分化频率最高。分化芽数最多，叶片次之，下胚轴最低．户—一 6．芥菜外植体高频遗传转化体系的建立? 睦最适培养基上试验了两类芥菜的三种外植体对卡那霉素的敏感性、预培养天数、浸菌 时间等因素的影响，建立了芥菜高频转基因再生体系；取生长4天的芥菜子叶、下胚轴和25 天的叶片在分化培养基上(MS+BA3．Omg／L+NAAO．1ing／L)预培养2-3天后，投入农杆菌菌液中 没染20分钟，在分化培养基上暗培养2天，正常条件下培养2天后，转入抗性培养綦 (MS+BA3．Omg／L+NAAO．1mg／L+CarbSOOmg／L+Kan30mg／L)筛选抗性愈伤组织和抗性芽，每两周 (MS+BA3．Omg／L+NAAO．1mg／L+CarbSOOmg／L+Kan30mg／L)筛选抗性愈伤组织和抗性芽，每两周 更换一次培养基．经多次继代筛选。再在生根培养基上(MS+NAAO．2mg／L+Carb300mg／L+Kan30 mg／L)生根·获得了具有Ran抗性的叶用和茎用芥菜的转基因再生苗。，扩 7．转基因芥菜植株的鉴定．· 缸再生苗的叶片提取DNA，进行PCR扩增和PCR—S。uthern b1。t分毫斤，转化再生植株大 部分星阳性 CpTI基因已存在于芥菜基因组中．同时在 室内进行了 明显高于对照．转基因檀株之间存在抗虫 性差异． 关键词t豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，芥菜，转化， 抗虫 2 Study Study OU isolation of Cowpea Trypsin Inhibitor gene and its transformation into mustard(Brassicajuncea Coss) Abstract By mearls of plant genetic engineering，foreign insects resistance gene carl be transferred into plant cell．we cloned the CpTI gene and transferred it into mustard by Agrobacterium-mediated transformation method。and obtained the transgenic mustard plants．The main results are船follows： 1．1solation of CpTI gene Total RNA WaS isolated from cowpea seeds、cotyledons and leaves．The CpTI gene fragment WaS amplified by RT．PCR using sequences ofits two sides∞pfimem． 2．Cloning ofthe PCR products The PCR products were purified