胶原膜携带抗体的方法学研究-生物医学工程专业论文.docxVIP

y y 761957 中国协和医科大掌中国医学科掌院硕士学位论文 胶原膜携带抗体的方法学研究 (本课题受国家自然科学基金项目、天津市重点 项目、博士点基金项目资助1 研究生：刘兰霞 导 师：冷希岗研究员 宋存先研究员 专 业：生物医学工程 入学时间：2003年8月 所在院所：生物医学工程所 2005．6 麓鼠帮总勿全文公石1。 中国协弃口医科大掌硕士学位论文中文摘要 中国协弃口医科大掌硕士学位论文 中文摘要 经皮冠状动脉腔内成形术(percutanerous transluminal coronary angioplasty PTCA)后再狭窄是急需解决的临床难题，药物涂层支架与基因治疗联合抑制 PTCA术后再狭窄是目前的研究趋势。涂层材料是影响药物涂层支架性能优劣的 重要方面。胶原作为一种结构蛋白，广泛存在于人类与动物体内，具有良好的 生物相容性和生物可降解性，并且经酶解处理的胶原几乎没有抗原性，通过改 变胶原的交联程度可以控制其载药量和缓慢释放速度，已被作为药物缓释载体 广泛使用。研究证实用胶原对支架涂层修饰可提高支架的血液相容性，并且可 显著提高所携带的基因的转染效率。因此胶原蛋白作为支架涂层材料具有广阔 的应用前景。 自从Nabel等在血管组织中成功表达转基因病毒至今，已有多种基因在动 物模型中证明有明显的抑制血管再狭窄的作用。目前基因治疗存在的普遍问题 是缺乏高效靶向的导入系统，涂层支架携带基因具有独特的优越性，既可以使 基因随支架在病变部位达到较高的浓度，又可以通过不同的涂层材料以不同的 机制缓慢释放达到长期的治疗作用。基因载体在基因导入系统中起着重要的作 用，基因载体主要有两大体系：病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体具 有高效转染和表达的优点，但是由于其有致命的安全性问题，因此目前有关非 病毒载体的研究越来越多，非病毒载体虽然相对安全，但是其转染效率低。目 前应用较多的非病毒载体是阳离子脂质体，为了达到较高的转染效率，往往需 要较高的浓度．而提高浓度时又会增加细胞毒性。Burton等研究发现，在细 胞培养中选用抗DNA抗体一阳离子脂质体一质粒DNA三元复合载体作为基因转 移载体，在提高基因转染效率的同时，又可减少阳离子脂质体的用量而降低其 细胞毒性，是一种新型的安全高效的转基因载体。 如通过化学偶联作用将DNA抗体连接在胶原膜上，以此将三元复合体连接 在胶原涂层支架上，既可以提高支架的血液相容性，又可以实现治疗基因的靶 向定位和局部的高效转染，这将有可能大大降低PTCA术后再狭窄的发生率。 以往研究利用胶原基质作为基因载体时是通过物理吸附的方式实现的，携带的 基因被过早洗脱掉是该方法面临的主要问题。本文利用”6I标记抗体的方法， 以SPDP作为化学偶联剂将抗体共价连接到胶原膜上，并通过改变胶原成膜的 中国协和医科大掌硕士掌位论文条件及投入的IgM的浓度，寻找同等体积的胶原膜上最大限度携带抗体IgM的 中国协和医科大掌硕士掌位论文 条件及投入的IgM的浓度，寻找同等体积的胶原膜上最大限度携带抗体IgM的 方法。结果显示：对照组胶原膜通过物理吸附的方式携带的抗体量为(0．049 ±0．0047)№，实验组通过化学偶联和物理吸附的方式携带的抗体量为 (0．72925±0．1445)肛g，进行差数显著性检验，t=8．14586，p=O．00125，实 验组较对照组有显著差别。制备胶原膜时投入不同的SPDP量对胶原膜携带抗 体量的影响实验显示：在1．6ml 0．3％胶原溶液与loo山0．IM NaOH和100 pl PBS的混合液中，加入0．1mg SPDP，胶原膜上携带的抗体量最大，并且稳定性 较好。不同抗体浓度对胶原膜携带抗体量的影响实验显示：与400¨l 0．24％胶 原混合液(已加入0．025mgSPDP)所成胶原膜反应的抗体浓度为0．4mg／ml，体 积为80斗l时，胶原膜上携带的抗体量基本饱和。抗体活性检测实验证实通过 化学偶联作用连接到胶原膜上的IgM仍具有结合DNh的活性． 关键词：”5I IgM胶原 药物涂层支架 基因治疗 2 中国协和医科大学硕士学位论文 中国协和医科大学硕士学位论文 Abstract It is urgent in clinic to eliminate restenosis that occurs after percutanerous transluminal coronary angioplasty(PTCA)．A better way to prevent it from happening is to combine drug—coating stents with gene therapy．Coating materials play an import