姜黄素抗角膜基质细胞纤维化的初步研究-中西医结合临床专业论文.docxVIP

L ¨ ¨ 1|llI 川 1111ll Y1 900805 目 录 中文摘要 1 英文摘要 4 研究论文 姜黄素抗角膜基质细胞纤维化的初步研究 前言丹IJ舌 。77 材料与方法 8 结果 13 附图 15 附表 18 讨论 19 结论 21 参考文献 22 综述 姜黄素的研究进展及在眼科临床的应用 25 致谢 36 个人简历 37 中文摘要姜黄素抗角膜基质细胞纤维化的初步研究 中文摘要 姜黄素抗角膜基质细胞纤维化的初步研究 摘 要 角膜受到创伤或手术后，受损的上皮细胞诱导角膜浅基质层细胞凋 亡，新形成的角膜基质胶原纤维紊乱排列，邻近的角膜细胞活化并增殖为 成纤维细胞，活化的成纤维细胞向伤口处移行，即构成了不透明的角膜瘢 痕组织，并完成角膜伤口愈合过程。其中活跃增生的角膜基质细胞在纤维 化过程中发挥重要作用。然而，角膜过度纤维化会导致瘢痕形成严重，降 低角膜透明度，如瘢痕位于角膜中央，则会严重影响视功能。目前，用于 控制角膜过度纤维化的药物主要有皮质类固醇和抗代谢药物等，但由于具 有明显的副作用而限制了它们的临床应用。因此，寻找安全有效的控制角 膜基质细胞过度纤维化的药物一直是角膜创伤愈合研究和临床工作中的 重要课题。姜黄素(curcumin)是从姜科植物姜黄中提取的一种植物多酚， 其药理作用尤其抗纤维化作用逐渐引起人们的重视，成为研究热点。有研 究表明，姜黄素可明显减轻肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化程度【l】，但有 关姜黄素是否会影响角膜基质细胞纤维化的研究尚少。本研究预培养离体 小鼠角膜基质细胞，并将不同质量浓度的姜黄素分别作用于小鼠角膜基质 细胞向角膜基质成纤维细胞方向转化的过程中，用逆转录聚合酶链式反应 法(reverse仃anscription PCR，RT．PCR)、MTS法及免疫荧光法等观察不 同质量浓度姜黄素对这一过程的影响，以探讨姜黄素的抗角膜基质纤维化 的作用，为角膜创伤后瘢痕愈合的临床用药提供参考。’ 目的：观察不同质量浓度姜黄素对这一过程的影响，以探讨姜黄素的 抗角膜基质纤维化的作用，为角膜创伤后瘢痕愈合的临床用药提供参考。 方法： 1选取清洁级健康BALB／c小鼠，6．8周龄，体重25—309，雌雄不限，无 眼部疾病。将小鼠断颈处死，眼球剜出后置于含4 g／L庆大霉素的PBS中 浸泡15 min。无菌环境下，将角膜沿角巩膜缘剪下，置于含20 IIⅡIlol／L 乙二胺四乙酸(EDTA NA2)的PBS中，37℃条件下孵育45 min。手术 显微镜下，用显微镊子撕除角膜上皮以及内皮后，将角膜基质置于含 3×105肌I型胶原酶的DMEM中，37℃条件下消化4 h后离心，再将角 中文摘要 中文摘要 膜基质细胞重悬于D砸M中。在光学显微镜下观察该原代角膜基质细胞 的形态学特征。 2以原代角膜基质细胞为受试对象，DMEM+lO％FBS做为诱导剂，将原 代角膜基质细胞以相同数量级(5×104个／L)培养于以下五组培养液中： (1)对照组：即角膜基质细胞诱导组(DⅧM+10％FBS，含1％oDMSO)。 (2)低剂量组(DMEM+10％FBS+7．5 n儿姜黄素，含l‰DMSO)。(3) 中剂量组(DMEM+10％FBs+10 II儿姜黄素，含l‰DMSO)。(4)高剂 量组(DⅧM+lO％FBS+12．5 m／L姜黄素，含1％oDMSO)。(5)E．无诱导 剂组：即原代角膜基质细胞组(DⅧM，含1‰DMSO)。每3天换液一 次，培养周期为7 d。药物分别作用7天后，应用ImPCR法，分别提取 以上五组细胞的砌蛆，并进行反转录获取cⅨ蛆。PCR扩增相关的细胞 标志性基因：角膜蛋白多糖(keratocall)、醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase， ALD四、CD90、dec嘶n、舶roneCtill．1(引物见表1)。PCR产物经1％琼 脂糖凝胶电泳后成像。观察不同质量浓度姜黄素作用下各细胞表型表达的 变化趋势。 3将原代角膜基质细胞以5×104个／ml接种于96孔板中，以上述A、B、 C、D组培养液作用7d后，每孔加入新配制的MTS 20山(59／L)，4 h后 弃去上清，用酶联免疫检测仪在490眦波长测定各孔的吸光度值(～90)。 每组设平行复孔6个，重复实验3次。计算上述各组中姜黄素对角膜基质 细胞增生的抑制率(％)=(1．实验组～90／对照组～90)×100％，并进行 比较。上述实验组在进行药物干预前均用锥虫蓝染色，对活细胞率进行检 测，以观察姜黄素的细胞毒性。 4角膜标本取出后立即经OCT包埋并切片(厚度为5岬)，冷丙酮固定 10 min后风干，PBS冲洗3次，10％山羊血清封闭40 miIl，以兔抗鼠 fibronectin-1抗体(1：50)4℃孵育过夜后用P