角膜脱细胞基质为载体构建角膜上皮-支架-内皮复合物-眼科学专业论文.docxVIP

y／60028学位论文独创性声明 y／60028 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：』盟晚超正u。 学位论文使用授权声明 本人完全了解上海第二医科大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有 权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。 有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查 阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题 和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后 角膜脱细胞基质为载体构建角膜．t-．皮一支架～内皮复台物中文摘要 角膜脱细胞基质为载体构建角膜．t-．皮一支架～内皮复台物 中文摘要 角膜脱细胞基质为载体构建角膜上皮．支架．内皮复合物 摘要 关键词： 脱细胞基质；载体；细胞培养；生物角膜 角膜盲的复明手段主要依赖角膜移植，但受到供体角膜来源紧缺、免疫排斥反应、 角膜供体老龄化等因素限制。在合适的载体上体外培养角膜缀缒褐建生物全层角膜为解 决这一问题提供了新希望。目前以胶原或人工材料构建出的全层角膜雏形不具备正常角 膜良好的透明、届光，韧性等理化特征。角膜脱细胞基质保留了正常角膜的扳层排列结 构，具有三维支架的～定孔隙，良好的韧性和适合细胞生长、近似生理的微环境，且抗 原性降低，生物相窖性好，可望成为体外构建角膜的理想载体。 本实验探讨猪角膜脱细胞基质(CorneaAcellularMatrix．CACM)的制备方法，以保留 正常角膜基质的网络结构、良好黏附性、生物安全性并产生一定大小孔隙。以CACM为 载体体外构建具有角膜上皮一支架一内皮结构的复台物，研究细腿在支架上的组织形态学， 检测细胞增殖黏附及关键蛋白的表达情况．评估CACM作为载体构建生物角膜的可行性。 以CACM作前板层移植观察其激发宿主应答。促进细胞粘附和增氇的反随效果。本实验 为生物功能性全层角膜的研究工作奠定基础。 目的 建立各种角膜细胞稳定的体外培养和扩增体系；探讨和完善角膜脱细胞基质 (CACM)的制备方法；评价CACM的生物安全性：以CACM为载体体外构建角膜上 皮一支架．内皮复合物，评估CACM作为体外构建生物角膜载体的可行性：研究CACM作 前板层移植后的转归。 材料与方法 1．分别采用组织块贴皿法、胶原酶消化法、后弹力层保存胰酶消化法分离角膜上度、 基质、内皮细胞，含不同浓度胎牛血清的DMEM／F12培养基在体外进行匾代及传代培养 扩增，倒置相差显微镜对细胞生长的动态变化进行观察、记录。内皮细胞作锥兰联合茸 素红染色评价形态与活性，基质细胞作vG染色观察殷原形成情况。 2．应用去垢剂TritortX，100振洗，冷冻千燥处理得到猪CACM，通过HE染色、扫 辅l酉 角膜聪细胞基质为载体掏建角膜t皮一支架一内皮复台物描电镜观察作组织学检测，摄片记录。将猪CACM植入兔角膜板层问观察6周，取材 角膜聪细胞基质为载体掏建角膜t皮一支架一内皮复台物 描电镜观察作组织学检测，摄片记录。将猪CACM植入兔角膜板层问观察6周，取材 作组织切片，评价其组织生物相客性。 3．CACM复水后．在载体两侧分别接种兔角膜上度和内皮细胞，上皮细胞予以复种， 架空培养。两周后作HE染色，扫摧电镜检查，角膜上皮特异性蛋自K3免疫组化，内 皮面作锥．茜染色。 4．兔跟角膜前板层切除，将猪CACM切削成相同厚度移植到切除角膜前板层的兔眼， 以新鲜猪角膜前板层移植作对照，通过角膜透明度、组织切片观察8周，评价异种CACM 的生物相容性及研究移植后材料内宿主细胞迁入、植片转归的情况。 结果 1．角膜缘组织块接种后上皮细胞爬出6—7目基本融合，为多边形的上皮细胞形态， 传至第三代较老化。基质细胞呈典型成纤维细胞形态，易传代，4-5代细胞培养一周后 VG染色显示细胞间有少量粉色着染的胶原丝样结构。内皮细胞为多边形或六边形铺路 石样整齐排列，锥一营染色显示缅胞活性高。 2．CACM的HE染色显示细胞脱净，胶原纤维排列较疏松，板层结构同正常角膜； 扫描电镜CACM表面未见细胞结构，纵切面上胶原板层间出现清晰的空穴状裂隙； CACM植入兔角膜层间后，未见明显排异反应。 3，以CACM为支架构建的复合物～侧是4-5层扁平细胞为主的复层结构，胞质内角 蛋白K3阳性。另一侧为连续单层细胞，锥．茜染色来见明显核蓝染，镜下见蜂巢样镶嵌 结构。扫描电镜观察在载体一侧，细胞复层样生长，形态近似扁平与梭形；另一侧为多 边形单层细胞，表面具有微绒毛结构。 4．猪CACM作兔前板层移植后。未见明显的新生血管、