姜黄素抑制培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞增殖及炎前因子分泌的实验分析-眼科学专业论文.docxVIP

姜黄素抑制培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞增殖 姜黄素抑制培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞增殖 及炎前因子分泌作用的实验研究 摘要 目的 l、研究姜黄素是否抑制体外培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞 (hfRPE细胞)增殖和重组人白介素卜B(rhIL-1 B)刺激hfRPE细 胞分泌炎性因子IL-8和sICAM-1。 2、探讨核转录因子K B(N卜K B)在其中的作用，从而探索针对 NF—K B的药物治疗增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的可能性。 方法 1、用已经成熟的酶消化法分离人胚胎RPE细胞，进行形态学观 察并用免疫组织化学法做抗人角蛋白抗体鉴定。取3-6代细胞用于实 验。 2、四唑盐．(MTT)比色法检测不同浓度(0，2．5，5，10，20 p g／m1)和处理时间(24和48h)下姜黄素对hfRPE细胞增殖活性的影 响，根据A值计算出相应的细胞增殖抑制率。 3、流式细胞术(FCM)分析不同浓度(0，5，10，20 la g／m1)姜黄素 处理hfRPE细胞24h后细胞周期的改变和细胞凋亡率变化。 4、ELISA法检测rhIL-1 B(5ng／m1)和姜黄素诱导hfRPE细胞 分泌IL一8和sICAM一1的量。hfRPE细胞经含0．4％FBS的DMEM／F12同 步后分为四组：(互)rhIL一1 B干预组；(虿)rhIL—l B+姜黄素组，姜黄素 分5u g／m1和10la g／ml两个浓度；③姜黄素组，只分别加入5u g／ml 和lO u g／ml姜黄素；④空白对照组(O．4％FBS+DMElIl／F-12)。所有样 本干预蛳后收集培养上清液和该孔细胞蛋白裂解液。用ELISA法检 测培养上清液中IL-8和sICAM-1含量，Bradford法测定细胞蛋白含 量，每孔上清中的IL-8和sICAM-1含量与相应细胞蛋白含量之比 (pg／mg)表示该孔细胞的IL一8和sICAM一1分泌量。 5、免疫荧光染色检测hfRPE细胞NF—K B活化：hfRPE细胞经含 0．4％FBs的DMEM／F12同步后分为四组：①rhIL-1 B 5ng／ml干预组， 加药30min后收集玻片；②rhIL一1 13 5ng／ml+姜黄素组，分5 u g／m1 和10 u g／ml两个浓度，先加姜黄素预处理1h，再加入rhIL一1 B干预 30min收集玻片；③姜黄素组，分为5 30min收集玻片；③姜黄素组，分为5 u g／ml和10 u g／ml两个浓度， 1．5h后收集玻片：④空白对照组(O．4％FBS+DMEM／F一12)。计数核荧 光阳性者细胞占全部细胞的百分数。 6、用基于ELISA的NF—K Bp65活性测定试剂盒观察经不同处理 的hfRPE细胞核转录因子NF—K B活性：hfRPE细胞经含0．4％FBS的 DMEM／F12同步后分为七组：(DrhIL一1 B 5ng／ml干预组，加药30min 后收集细胞；(窑)rhIL～1 B 5ng／ml+姜黄素组，分5 u g／ml和10 u g／ml 两个浓度，先加姜黄素预处理1h，再加入rhIL-i B干预30min收集 细胞；@rhIL一1 B 5ng／ml+PDTC组，分5 p g／ml和10 1．t g／ml两个浓 度，先加PDTC预处理1h，再加入rhIL一1 B干预30min收集细胞；④ 空白对照组(0．4％FBS+D肛M／F一12)；⑤姜黄素组，只分别加入5 p g／ml和10|l g／ml姜黄素；(亘)PDTC组，只分别加入5u g／m1和10u g／mlPDTC；⑦阳性对照组，加入10％FBS30min后收集细胞。所有标本 按试剂盒说明提取全细胞蛋白并定量后检测NF—K B活性。 结果 1、姜黄素以剂量和时间依赖方式抑制hfRPE细胞增殖。经统计 学分析，2．5 1．t g／ml以上浓度姜黄素均能显著抑制hfRPE细胞增殖， 24h和48h半数抑制浓度(I％)分别为14．27 u g／ml和12．7 u g／ml。 姜黄素抑制hfRPE细胞增殖具有时间和剂量依赖性。 2、姜黄素诱导hfRPE细胞发生G。朋期阻滞，未出现凋亡峰。 3、rhIL-I§(5ng／m1)组hfRPE细胞分泌的I乙-8和slCAM一1 分别比空白对照组升高了20倍和8倍，加入姜黄素能显著抑制其分 泌。5 u g／ml姜黄素使IL一8和slCAM一1含量分别降低了36．88％和 14．90％，10 la g／ml则分别达到55．73％和41．78％。姜黄素本身不刺激 hfRPE细胞分泌IL-8和sICAM一1。 4、IL-I 13刺激hfRPE细胞30min后出现p65核染色，90％细胞核 p65染色阳性；加入姜黄素5u g／ml和10u g／m1分别使细胞核p65 染色阳性细胞减少了12％