胶质瘤干细胞样细胞中MGMT表达以及与替莫唑胺耐药相关机制研究-药剂学专业论文.docxVIP

广东药学院硕士学位论文胶质瘤干细胞样细胞中 广东药学院硕士学位论文 胶质瘤干细胞样细胞中 MGMT 表达以及与替莫唑胺耐药相关机制研究 I I 胶质瘤干细胞样细胞中 MGMT 表达以及与替莫唑胺 耐药相关机制研究 中文摘要 第一章 胶质瘤干细胞样细胞体外培养和鉴定 背景与目的：肿瘤干细胞样细胞（stem-like cancer cells, SLCCs）被认为是肿瘤复 发的根源之一。肿瘤干细胞样细胞凭借其自身更新能力与处于静止期的特性，摆 脱药物杀伤作用，继而导致肿瘤在放化疗后复发。同时，O6 甲基鸟嘌呤 DNA 甲 基转移酶（O6methylguanine DNA methyltranferase，MGMT）是一种能将 DNA 上加合物移除，并可修复损伤 DNA 的酶，临床上影响烷化剂化疗效果。本研究 选取 MGMT 低表达或阴性表达的人脑胶质瘤细胞株，通过“悬浮克隆球形成法” 纯化为胶质瘤干细胞样细胞，并对纯化后的胶质瘤干细胞样细胞的肿瘤干细胞特 性进行鉴定。 方法：选用 MGMT 低表达或阴性表达的人脑胶质瘤细胞株 U251、U373、 SKMG-4、SF295、SKMG-1、U87、MGR1 和 MGR2，采用“悬浮克隆球形成法” 将胶质瘤细胞株纯化为胶质瘤干细胞样细胞 U251G、U373G、SKMG-4G、 SF295G、SKMG-1G、U87G、MGR1G 和 MGR2G。体外无血清培养，通过免疫 荧光技术检测干细胞分子标志物 CD133、Nestin、Sox-2 以及谱系分化标志物 GFAP 和 TuJ1；建立裸鼠皮下肿瘤异种移植模型研究胶质瘤干细胞样细胞致瘤 性，每 2 天观察一次。观察肿瘤出现时间，并用游标卡尺量度肿瘤最大直径。 结果：经“悬浮克隆球形成法”纯化后的胶质瘤干细胞样细胞 U251G、U373G、 SKMG-4G、SF295G、SKMG-1G、U87G、MGR1G 和 MGR2G。在干细胞培养 液中呈悬浮肿瘤球状生长，能连续传代并保持较好的增殖生长能力。胶质瘤干细 胞样细胞高表达 CD133、Nestin 和 Sox-2，并且低表达分化谱系标记 GFAP 和 TUJ1。皮下注射 1×104 个胶质瘤干细胞样细胞和 1×104 个胶质瘤细胞 6 周后， II II 胶质瘤干细胞样细胞和胶质瘤细胞株所对应的裸鼠均能成瘤。胶质瘤干细胞样细 胞瘤体最大直径为 1.4±0.7cm，胶质瘤细胞株瘤体最大直径为 0.6±0.4cm。胶质瘤 干细胞样细胞所致的瘤体最大直径比注射同等量贴壁生长的胶质瘤细胞所致的 瘤体最大直径明显大（P＜0.05）。 结论：经“悬浮克隆球形成法”纯化后的胶质瘤干细胞样细胞有肿瘤干细胞特性。 第二章 MGMT 在胶质瘤干细胞样细胞中的表达研究 目的：研究 MGMT 在胶质瘤干细胞样细胞中的表达状况。 方法：(1) 对胶质瘤细胞株和胶质瘤干细胞样细胞采用 RT-PCR 检测 MGMT 基 因表达；(2) 应用 western blot 检测 MGMT 蛋白在胶质瘤细胞株和胶质瘤干细胞 样细胞中的表达；(3) 使用甲基化 PCR（MSP）检测胶质瘤细胞株和胶质瘤干细 胞样细胞中 MGMT 启动子甲基化状况。应用 QauntityOne 软件和 CORELDRAWX4 软件对数据进行分析。 结果：(1) RT-PCR 检测观察得 U251、U373、SKMG-4、SF295、SKMG-1、U87、 MGR1 和 MGR2 8 株胶质瘤细胞株中除 U373 MGMT 基因为弱表达外，其余胶 质瘤细胞株为 MGMT 阴性表达；U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G 和 SKMG-1 G 中 MGMT 基因为阳性表达，而 U87G、MGR1G 和 MGR2G 中 MGMT 基因为 阴性表达。(2) Western blot 检测得 8 株胶质瘤细胞株中 MGMT 蛋白表达均为阴 性表达；胶质瘤干细胞样细胞中 U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G 和 SKMG-1G 中 MGMT 蛋白为阳性表达，而 U87G、MGR1G 和 MGR2G 中 MGMT 蛋白为阴 性表达。(3) MSP 检测得 8 株胶质瘤细胞株 MGMT 启动子均有甲基化，U373 MGMT 启动子弱去甲基化；胶质瘤干细胞样细胞均有 MGMT 启动子甲基化，而 U251G、U373G、SKMG-4G、SF295G 和 SKMG-1G MGMT 启动子同时存在去 甲基化，U87G、MGR1G 和 MGR2G MGMT 启动子无去甲基化。 PAGE PAGE IV 结论：部分胶质瘤干细胞样细胞为 MGMT 阳性表达，MGMT 启动子存在去甲基 化；但同时也有部分胶质瘤干细胞样细胞仍为 MG