金钱鱼MHCI类基因结构、多态性与组织表达分析及其线粒体基因组全序列分析-水生生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 杨金水 复旦大学 教授 主席 赵金良 上海海洋大学 教授 委员 张庆华 上海海洋大学 副教授 委员 委员 委员 委员 刘东 上海海洋大学 副教授 秘书 答辩地点 水产与生命学院 B102 答辩日期 2014.5.23 上海海 上海海洋大学硕士学位论文 金钱鱼 MHC I 类基因结构、多态性与组织表达分析及 其线粒体基因组全序列分析 摘 要 以金钱鱼为对象，利用 RACE-PCR 技术，克隆获得其主要组织相容性复合体 I 类 α 基因（Major histocompatibility complex，MHC I α）和 β2m 微球蛋白 （β2m-microglobulin）基因的全长序列，并分析其基因结构、组织表达情况及 MHC I α 的多态性；然后，运用间隔 PCR 法，获得了金钱鱼的线粒体基因组全长序列。 这些研究结果，既为今后探讨 MHC 基因多态性和抗病性的关系积累了基础资料， 又丰富了鱼类的线粒体基因库。论文的主要研究结果如下： 1 金钱鱼 MHC I α 基因结构及组织表达分析 运用 RACE 技术，首次成功克隆获得长度为 2020 bp 的金钱鱼 MHC I α 基因 的 cDNA 全长序列。该基因的开放阅读框（Opening reading frame，ORF）长 1068 bp，编码一个分子量为 40.09 KDa 并由 356 个氨基酸组成的前体蛋白，其第 1~19 位为信号肽（SP）；5’非编码区（5’-Untranslated Region，UTR）为 86bp；3’UTR 为 866bp，含有典型的多聚腺苷酸加尾信号 AATAAA 及 Poly A 尾巴。分析表明： 该序列含有经典的 MHC I α 基因结构，如 N-糖基化位点、N 豆蔻酰基化位点、蛋 白激酶 C 磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、酪氨酸激酶 II 磷酸化位点、cAMP- 与 cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸化位点和保守的半胱氨酸残基（C），在第 204~278 形成一个免疫球蛋白样区（Immunoglobulin-1ike region，IG-LIKE）。金钱鱼 MHC I α 分子为混合型蛋白，其中 α 螺旋（H）为 23.4%，β 片层（E）占 28.5%，无规 卷曲及 β 转角占 48.2%。对其氨基酸序列分析得知：金钱鱼 MHC I α 基因的与金 头鲷的相似率达 70%，与鲈的相似率为 68%，而与鲑鳟类、两栖类、鸟类、哺乳 类的相似率则依次降低。金钱鱼 MHC I α 基因含有 6 个内含子和 7 个外显子，其 内含子片段的长度分别为 541bp、335bp、446bp、655bp/691bp、433bp、300bp； 内含子 4 在同一个体中扩增出两种不同长度类型，显示出长度多态性，而内含子 6 却将 3’-UTR 区隔开，且所有内含子与外显子进行匹配的位点均为 gt/ag。用荧 I 光定量 PCR 法，检测金钱鱼 MHC I α 基因在不同组织中的表达情况，结果显示， 该基因在肾和脾等免疫组织中表达量较高，中等表达于胃、肝、心、脑和眼睛， 而在鳃、肌肉、肠等组织中的表达较弱。 2 金钱鱼 MHC I α 的多态性 从 42 尾金钱鱼的 210 个有效克隆中，获得长度为 1065~1074bp 的不同核苷 酸序列 208 条，共编码 163 条不同的氨基酸序列，这些序列都包含完整的 SP，α1、 α2 和 α3 结构域，连接肽、跨膜区及胞质区。参照之前的等位基因命名规则，可 归为 20 个等位基因主型及 135 个等位基因亚型，分别命名为 Scar-UA*0101~ Scar-UA*2001。分析显示，金钱鱼 MHC I α 基因的核苷酸与氨基酸序列的变异率 分别为 53.22%、70.22%；其 α1 和 α2 结构域的抗原肽结合区（PBR）的同义替换 率与非同义替换率的比值 ω（ω= dN/dS）均大于 1，而其非抗原肽结合区（non-PBR）、 总结构域及 α3 结构域的 ω 值都小于 1，说明 α1 和 α2 结构域在进化过程中受到正 向选择作用。运用 NJ 法构建的系统发生树中，金钱鱼首先与鲈聚为一支，而与 虹鳟、金头鲷、鲤和斑马鱼的亲缘关系相对较远。 3 金钱鱼 β2m 的基因结构及组织表达分析 金钱鱼 β2m 基因的 cDNA 全长为 905bp，预测编码 116 个氨基酸。它的 ORF 长 351 bp，5’ UTR 长 87bp；3’UTR 为 467bp，并含有典型的多聚腺苷酸加尾信号 AATAAA 及 Poly A 尾巴。金钱鱼 β2m 基因的氨基酸序列的分子量