免疫比浊技术原理及其简介.doc

PAGE PAGE 1 免疫比浊技术原理及其简介 免疫比浊技术是在免疫沉淀反应（抗原与相应抗体在液相反应时，如抗体结合位点略多于或等于抗原表位，二者交联良好，生成大的不可溶性免疫复合物的沉淀）检测法的基础上建立的。免疫学检验中最早应用的免疫沉淀反应是1948年Ouchterlony建立的琼脂双向扩散法（观察抗原孔与抗体孔之间是否出现沉淀线），1965年Mancini寺和Fahey等分别建立了可以定量的单向（辐射状）免疫扩散技术（观察沉淀环大小）.并广泛用于血清蛋白质（IgG、IgA、IgM、补体C3、c4等）的定最检测。为了缩短检测时间，Laurell等于1966年建立了电免疫扩散法（俗称火箭免疫电泳，观察沉淀峰高度），使报告结果的时间由单向免疫扩散法的gt;=24h缩短至4-5h。以上这些方法直到20世纪80年代末仍在临床广泛应用，但灵敏度（每1ml可检出最小量为”毫克”水平至”微克”水平）和精密度（变异系数gt;=10%）均较差，且操作繁琐、费时，不能自动化。 免疫比浊法是用透射比浊仪或散射比浊仪检测可溶性抗原抗体复合物;在液相中形成的浊度从而测定抗原的含量。1967年由Richie首次报告，20世纪70年代逐步完善，80年代初期初步用于临床常规检查，但直到美国Beckman公司推出的(immunochemistηsystems，ICS)自动化检测系统被众多实验室接受后，这一技术才得到广泛的临床应用。 原理 1.液相中抗原与抗体的反应结果与两者的浓度和比例有关(Heidelberger和Kendall曲线)。抗原或抗体显著过量时，都只能生成少量可溶性免疫复合物，分子极小，不适于免疫比浊法检测。免疫比浊技术要求溶液中抗体要保持中等过量，此时免疫复合物(IC)仍是可溶性的，为直径。.5μm大小的颗粒，相对分子质量相当于100X106。这样的IC有约100个抗原(Ag)分子和200个抗体(Ab)分子。在这种情况下，抗原与抗体的反应遵循质量作用定律(Ag+Ab====Ag·Ab)，形成IC(Ag·Ab)的 量是抗原或抗体量的函数。当抗体量固定时，IC的量与抗原的量成正比。 2.当一束入射光照射液相中上述条件下形成的IC时，一部分光被IC粒子吸收，一部分光透过，还有一部分光被IC粒子散射。利用比浊仪在光源的光路方向上测量透射光强度与人射光强度的比值或吸光值，来判断待测抗原的量，此法称为透射比浊法(turbidimetry)。如果是在光源光路的一定角度(如70°)测量散射光的强度，光电池上的电信号和散射光强度成正比，经微电脑转换成被测抗原的含量，此法称为散射比浊法(nephelometry)。 3.散射比浊法有的采用速采法(如BeckmanCoulter公司仪器)，有的采用终点法(如DadeBehring公司仪器)。终点法是在抗原抗体反应结束(一般15-30min)后，测定最终形成的IC的量。动态法是指在单位时间(每次5s)内观察抗原抗体反应的速度。研究证实，每个单位时间抗原抗体反应的速度并不相同，而是逐步加快，在一定时间(一般是在反应开始后10-45s)达到峰值后又逐步变慢。峰值的高低与抗原的含量成正比。用比浊仪测定抗原抗体反应速度的峰值，经数据处理即可得出抗原的浓度。目前的仪器.无论速率法还是终点法，其灵敏度、精密度和检测速度都基本相似。透射比浊法主要用于生化自动分析仪，使用开放试剂。高质量的仪器和试剂，可获得与散射比浊法近似的检测结果。 4.当标本中待测抗原过量时，常易出现Hook效应(假性低值)。如前所述，免疫比浊技术要求在抗体保持中等过量的前提下进行，此时，随抗原浓度的增加检测信号而增加(在Heidelberger-Kendall曲线上升处)。为了检测标本中抗原是否过量，不同的仪器设置了不同的预反应程序;有的是加入抗原，如检测信号继续上升，说明反应液中仍有游离抗体，抗原未过量，反之则说明抗原已过量，标本须进一步稀释。也有的是先让少量标本与抗血清混合，监测它们的反应，如检测信号超过了预反应设定的阈值，说明标本中抗原过量，仪器对标本自动稀释后再进行分析。