耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB-3基因的发现.doc

PAGE PAGE 1 耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB-3基因的发现 颜英俊　糜祖煌　刘华　杨洋　张凯　杨明清　黄文方　中华医学研究杂志 　　铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，Pa）是临床常见的条件致病菌，由于其固有和获得性耐药，使临床治疗成为一大难题。CARB基因编码产生羧苄西林酶，为β-内酰胺酶Bush分类中的2c，在我国CARB基因、流行基因亚型的研究未见报道。我们研究分析了2005年1～12月临床分离的34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IMPRPa），发现了我院IMPRPa携带CARB-3基因，现总结报告如下。 　　1材料与方法 　　1.1菌株来源与质控菌株34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于2005年1～12月我院住院病人的临床分离标本（包括：痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等），质控菌株包括：铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC25922。 　　1.2菌株鉴定及亚胺培南耐药菌株筛选试验菌株经BDPhoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种，采用该仪器配套药敏试验复合板筛选亚胺培南耐药的Pa。 　　1.3主要仪器设备与试剂Eppendorfcentrifuge5417R低温离心机，恒温金属浴（杭州大和），MJPeltierThermalCycler（MJResearch），Bio-RAD电泳仪，Bio-RAD凝胶成像系统，琼脂糖（OXOID），100bpDNALadderMarker（大连宝森），6×Loadingbuffer（北京天为时代）。 　　1.4模板DNA提取采用蛋白酶K消化法。 　　1.5基因扩增引物序列为：P1：5′-AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC-3′，P2：5′-TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC-3′，扩增产物为588bp。热循环参数为：93℃预变性3min，93℃60s，55℃60s，72℃60s，最后一个72℃延伸5min，共循环35周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。 　　1.6结果判断取10μl扩增产物与2μl6×上样缓冲液混匀，点样于1.5%琼脂糖凝胶，在100V电压电泳30min，出现588bp的条带即为CARB基因阳性。用凝胶成像系统观察并照相。 　　1.7序列分析PCR产物经纯化后送上海生工生物工程公司进行DNA序列分析，测得序列在中的BLASTn程序进行同源性和基因亚型分析。 　　2结果 　　2.1CARB基因PCR检测结果34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌共检出11株CARB基因阳性株，检出率为32.4%，PCR扩增结果见图1。 　　2.2序列分析结果任意抽取5株CARB基因阳性的PCR扩增产物进行单向测序，测得序列与GenBank中注册号为DQ309773的CARB-3基因完全同源（Identities=100%）。因此我院流行的CARB基因亚型为CARB-3型。 　　图1部分Pa菌株CARB基因PCR产物电泳图　（略） 　　3讨论 　　CARB基因最早于1981年在Pa中发现［1］，近年又从不动杆菌、弧菌属、奇异变形杆菌中检出，已发现CARB1-9型9个亚型［2～4］。我院IMPRPa的CARB基因携带率为32.4%，提示医务工作者应重视和加强Pa的防治和耐药监测。对CARB基因阳性菌株进行DNA序列分析，经同源性比较，结果显示：我院流行的CARB基因亚型为CARB-3型。IMPRPa中CARB基因检出、CARB-3基因亚型发现为国内首次报道。 　　铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌，正常情况下不感染人体任何组织，但当人体免疫力下降或严重创伤或医疗操作后，Pa几乎可以感染人体的任何组织，临床可表现为局部化脓性炎症和全身性感染，常常危及患者生命。碳青霉烯类抗生素（如亚胺培南）因其独特的抗菌优势，被临床广泛用于Pa引起的重症感染，导致临床分离株对亚胺培南耐药性增加。 　　Pa对亚胺培南耐药的机制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和产酶等三种机制［5］。我们对IMPRPa的耐药机制的相关研究正在进行中。 　　 　　【参考文献】 　　1PaulG,JolyGML,BergogneBE,etal.Novelcarbenicillin-lydrolyzingβ-lactamases(CARB-5)fromAcinetobactercalcoaceticusvar.anitratus.FEMSMicrobiolLett，1989,50(1-2):45. 　　2AlejandroP,RobertoGM,HectorAS,etal.CARB-9acarbenicillinaseencodedintheVCRregionofVibriocholeraeNon-O1,Non-O139belong