免疫化学和特定蛋白检测.doc

PAGE PAGE 1 免疫化学和特定蛋白检测 　　免疫化学是免疫学技术和生物化学技术的结合，它既具有免疫学抗原抗体结合的特异性，又具有生物化学反应动力学特点，可以在自动化生化分析仪上检测体液中，特别是血液中微量生物化学物质，是一种非常有应用前途的临床检验实用技术。根据免疫化学的基本原理而研制、开发的各种特定蛋白检测仪器已经广泛地应用在临床检验中，发挥越来越多的作用。 　　免疫化学是免疫学技术和生物化学技术的结合，它既具有免疫学抗原抗体结合的特异性，又具有生物化学反应动力学特点，可以在自动化生化分析仪上检测体液中，特别是血液中微量生物化学物质，是一种非常有应用前途的临床检验实用技术。根据免疫化学的基本原理而研制、开发的各种特定蛋白检测仪器已经广泛地应用在临床检验中，发挥越来越多的作用。 　　常用的免疫化学技术包括：免疫浊度法、胶乳免疫法、放射免疫法、酶免疫法、发光免疫法、时间分辨荧光免疫法、斑点免疫渗滤法和免疫电泳法，其中以免疫浊度法应用最为普遍。许多特定蛋白分析仪都是以免疫浊度法为设计原理的。 　　一、免疫比浊法 　　免疫浊度法的基本原理是在一定适宜的条件下，液体中特定抗原与其相应的抗体结合后，形成抗原-抗体复合物；这种难溶性的大分子复合物能在液相中产生浊度；然后可以利用外界光源的照射，或者检测溶液透射光减少的程度（免疫透射比浊法），或者检测复合物对光的散射程度（免疫散射比浊法）计算复合物的含量，再推算出溶液中待测抗原或抗体的含量。 　　透射比浊法（Turbidimetry）：根据Lambert-Beer定律，当一束光线通过带有微小粒子的悬浮液和胶体溶液时，此溶液受到光散射和光吸收两个因素影响可使光的强度减弱，减弱的程度与溶液中微小粒子的含量成正比。所以，当光线通过免疫复合物时，由于反应体系中复合物颗粒对光线的反射和吸收，引起透射光减少，测量通过反应体系后的透射光照到光电倍增管的光强度，或者测定反应体系的吸光度，推导出溶液中待测物质的浓度。 　　散射比浊法（Nephelometry）：根据Rayleigh定律，粒子被光照射后而发光，发光的轻度与粒子的大小以及照射光的角度有关。当光线通过免疫复合物时，由于反应体系中复合物颗粒可光线被折射，发生偏转；而这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别；通过测量在入射光的一定角度上复合物颗粒发出的散射光强度，推导出溶液中待测物质的浓度。根据测定方式的不同，散射比浊法又分为速率散射比浊法（Ratenephelometry）和终点散射比浊法（Endpointnephelometry）。 　　速率散射比浊法是一种抗原、抗体结合的动态测定法。所谓速率是指抗原－抗体在单位时间内结合的速度。速率法是测定最大反应速率，也就是抗原－抗体反应达到最高峰时形成免疫复合物的量。一般这个时间是几十秒，峰值的高低与待测物质（抗原）的量成正比，而形成峰值的时间与抗体（试剂）的浓度和其与抗原的亲和力有关。 　　终点散射比浊法是观察抗原和抗体反应达到平衡时，免疫复合物形成的量不再增加，反应体系的浊度不再变化，测定此时的溶液浊度。一般这个过程需要几十分钟，复合物的浓度不再受时间变化的影响，应当说是免疫反应的结束，但又不能出现絮状沉淀影响浊度的判断。 　　为了提高检测的灵敏度，就需要为抗原－抗体的结合创造条件。因此，人们采用一种带有载体的免疫比浊方法，即选择一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒，吸附上抗体（试剂）后，大大增加了抗原－抗体的接触机会，当遇到特异性抗原便可发生凝集。单个胶乳颗粒可允许光线通过，而两个胶乳颗粒凝集后，则使光线通过减少，减少的程度与胶乳颗粒凝集成正比，当然也就和带测抗原两成正比。 免疫化学技术中最关键的几个问题是：（1）抗原和抗体的制备，无论是使用抗原作为试剂检测待测标本中的特异性抗体，如不同类型病毒型肝炎的血清抗体、HIV感染后产生的抗体，还是使用抗体作为试剂检测待测标本中的抗原，如各种特定蛋白、病毒抗原、肿瘤组织抗原、激素、酶类等，都要求它们达到一定的纯度，具有特异性和反应的专一性。单克隆抗体的特异性显然远远高于多克隆抗体，基因工程制备的第三代抗体，又优于通过生物学方法制备的抗体。（2）标记物，要使免疫反应得到显示，必须在反应过程中加如不同的标记物，使抗原抗体结合后的复合物能表现出来，被容易地检测到。这些标记物有荧光素、放射性核素、酶、化学发光物质等高灵敏度物质，放大了反应效果，提高了检测的灵敏度。（3）检测系统，主要包括光源、检测器、光电转换器和计算机软件。为了保证检测的灵敏度和精密度，对上述设备性能要求是非常高的，而且必须定期地检测、校准。（4）反应条件，包括试剂中含有的各种缓冲液、稀释液、清洗液，特别是反应所规定的pH值、离子浓度以及温度等。（5）标准曲线的建立，任何生物