汉坦病毒基因重排的实验研究-病原生物学专业论文.docxVIP

第四军医大学博士学位论文汉坦病毒基因重排的实验研究 第四军医大学博士学位论文 汉坦病毒基因重排的实验研究 研究生：康文臻 导 师：杨为松白雪帆 辅导老师：黄长形 第四军医大学唐都医院感染病科 2001年6月西安 摘 要 f当不同型或亚型节段性RNA病毒混合感染同一宿主或靶细 胞时，可以发生基因片段的重排。这在某些病毒如流感病毒、轮 状病毒、环状病毒的进化、发病机理、流行病学上具有重要作用。 关于自然发誊及实验条件下的布尼亚病毒科病毒的基因重排已有 较多报道9)汉坦病毒∞髓ta、，imses，Hv)属于布尼亚病毒科汉坦病毒 属，其基因组由三段单股负链RNA组成，每个片段的两末端均有 长约20个碱基左右的互补序列，国外学者对引起汉坦病毒肺综合 征的汉坦病毒的基因重排进行了研究。但迄今为止，对其它型别 汉坦病毒之间是否能发生基因重排国内外尚未见报导。 由研究用相同滴度的汉坦病毒HTN型与SEO型(76．118株 与SR．11株)，及汉坦病毒HTN型与PHV型(76．118株与PHV 株)毒株分别混合感染Vcro E6细胞，不同时间刮片做免疫荧光检 测“待荧光达+++～卅+时收获毒种，用空斑形成试验挑选子代 第四军医大学博士学位论文病毒克隆，挑得的单个病毒克隆在Vero 第四军医大学博士学位论文 病毒克隆，挑得的单个病毒克隆在Vero E6细胞上扩增≯分别用针 对汉坦病毒HTN型与SEO型、HTN型与PHV型的L、M、S三 个基因片段的分型引物对子代病毒进行RT-PCR实验，以确定子 代病毒L、M、S片段核酸的来源，鉴定子代病毒基因型。f结果发 现76．118株与SR．II株混种的子代病毒株13／44株(29．55％)来源于 76—118株；17144株(38．64％)来源于sR—ll株；2／44株(4．55％)HTN 型与SEO型引物扩增均为阳性；2／44株(4．45％)HTN型与SEO型 引物扩增均为阴性；5／44株(11．36％)L、S片段均来源于76—118株， 而M片段来源于SR．11株，即发生了M片段重排；3／44株 (6．82％)M、S片段均来源于SR。11株，而L片段来源于76．118株， 即发生了L片段重排；未发现S片段重排；1株L、S片段均来源 于SR．11株，M片段来自双亲； 1株L片段来源于76．118株，M 片段来源于76．118株，而s片段来自双亲，即这些片段为双倍体。 76．118株与PHV株混种的子代病毒株基因14／36株(38．89％)来源 于PHV株，11／36株(30．56％)来源于76．118株；5／36株(13．89％)HTN 型与PHV型引物扩增均为阳性；1株(2．78％)HTN型与PHV型 引物扩增均为阴性；I株(2．78％)子代病毒L、s片段均来源于 76．118株，而M片段两种引物扩增均为阳性，2株(5．55％)子代 病毒L片段来源于76—118株，S片段来源于PHv株， M片段两 种引物扩增均为阳性，1株(2．78％)子代病毒L、S片段均来源 于76—118株，而M片段来源于PHV株。7株毒株两型引物扩增 均为阳性，可能是由于：①挑斑过程中感染了两种病毒，可能是由 于出斑过多，挑斑时污染了邻近空斑的病毒，或由于无斑区存在 极微量的病毒，但未出现可见的空斑；②病毒发生了基因重排或 变异。两型引物扩增均为阴性的3株毒株在Vero E6细胞中传代后 免疫荧光检测抗原始终为阴性，故推测可能是由于：①挑斑时未 免疫荧光检测抗原始终为阴性，故推测可能是由于：①挑斑时未 挑到病毒；②传代过程中病毒死亡或病毒滴度过低。比较这两组 结果发现，76—118株与SR-11株混种的子代病毒株的基因重排率 (20．45％)明显高于76．118株与PHV株混种的子代病毒株 (8．33％)。这种重排率的差异可能是由于HTN型与SEO型HV 基因核酸序列之间的同源性较高，而更容易发生基因重排。而HTN 型与PHV型HV基因核酸序列之间的同源性较低，发生基因重排 的机会显著降低。不同宿主来源的毒株能够发生重排，表明自然 界可能会出现新的毒株类型。 选取4株基因重排毒株利用在Vero E6细胞中增殖特性的观 察、对乳小鼠致死性实验对基因重排病毒株的生物学特性进行了 初步观察，发现部分重排毒株在毒力和生物学特性上与亲代病毒 株有显著差异。汉坦病毒基因片段与其毒力和生物学特性的确切 关系还有待于深入研究。 本研究首次证实了汉坦病毒HTN型与SEO型、HTN型与 PHV型病毒之间可以发生基因片段的重排。HV基因重排的发现 使人们可以利用重排汉坦病毒研究Hv基因片段组成与病毒生物 学特性的关系，分析各基因片段对生物学特性的影响，并为进一 步了解HV的变异规律、肾综合征出血热发病机理、在我国流行 趋势的预测以及HV疫苗的