实验一 实验要与生物安全.docVIP

实验一 实验要求与生物安全 （一）实验前准备——预习并复习PCR的反应原理及基本过程 （二）实验要求——严肃认真、安全规范 1、不迟到早退、不无故缺席、按要求着白大褂 2、保持安静和秩序、不在教室接听手机和喧哗 3、听从安排，严格遵守操作规程 4、公用物品及时放回 5、爱护仪器设备、保持清洁卫生 6、注重仪器和试剂使用的安全 操作中注意事项： 注意无菌操作并防止RNase污染 注意移液器（枪）的使用 注意离心机必须平衡 防止试剂造成皮肤伤害 实验二 乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测 【标本采集】 样品可采用血清或血浆样本，血浆采用3%枸橼酸钠抗凝，抗凝剂：血液为1：9。 【操作步骤】 待测样品处理（将［阴性对照］、［工作标准品①］、［工作标准品②］、［工作标准品③］、［工作标准品④］与待测标本同步进行处理） (在标本处理区进行) 1.1 用带滤芯吸嘴吸取100μl［样品处理液A］于0.5ml离心管中。 1.2 加入100 μl被测标本。 1.3 盖上管盖，振荡混匀，13000rpm离心10分钟（离心时固定离心管方向）。 1.4 吸弃上清（沉淀不明显，需在离心管底部沉淀对侧吸上清，应一次吸尽上清，避免搅动或碰到沉淀）。 1.5 再加入25μl［样品处理液B］。 1.6 振荡混匀，低速（2000rpm）离心数秒后，100℃干浴或沸水浴10 1.7 13000rpm离心10分钟，取上清为PCR反应模板。 （上清如不立即使用，须置-20℃保存,重新使用时需13000rpm离心10 2. PCR试剂准备（在PCR前准备区进行） 2.1 取试剂盒中［PCR反应液A］、［PCR反应液B］、［PCR反应液C］室温融化混匀后，低速（2000rpm）离心数秒。 2.2 根据待扩增样品数按［PCR反应液A］：［PCR反应液B］：［PCR反应液C］=13.5：13.5：1的比例配制PCR反应液，并分装至PCR反应管中，每管28μl，将装有PCR反应液的反应管转移至标本处理区。 3. 加样（在标本处理区进行） 在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入2μl已处理好的标本（标本处理步骤1.7的上清）。盖上管盖，转移到扩增检测区。 4. PCR扩增检测（在扩增检测区进行） 将反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。 循环参数设定：（请参照各类仪器的操作软件进行设置） 步骤 温度 时间 循环数 1 UNG酶反应 50 2分钟 1 2 预变性 94 2分钟 1 3 变性 94 10秒 40 退火、延伸及检测荧光 60 30秒 4 仪器冷却 35 10秒 1 步骤3中60℃时荧光检测，检测通道：530nm （FAM） 4.3 样品设置 在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型及工作标准品参数（见试剂盒内提示）。 【结果分析】 根据各类仪器的软件进行分析，得到各标本的HBV DNA检测结果。 （基线选取6～10或6～15个循环，阈值线选在阴性对照正常扩增曲线的上方） 【结果判断】 1.对于500≤测定拷贝数＜108 拷贝/ml的样本，报告相应的测定结果。 2.对于测定拷贝数≥108拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明≥108拷贝/ml。若需精确定量，可根据所测结果，将该标本用阴性血清稀释至105～106拷贝/ml后复测。 3.对于测定拷贝数＜500拷贝/ml的样本，所测结果仅供参考，报告上注明＜500 拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。 4.对于HBV 扩增阴性的标本（Ct无数值），报告上注明＜500 拷贝/ml或低于试剂盒检测下限。 【注意事项】 1.待检新鲜血清或血浆若不及时检测,应保存于-20℃。 2.试剂盒各组份使用前请充分融化并摇匀,离心管内的试剂需离心数秒后使用。 3.PCR操作各阶段应在不同实验区域进行，包括PCR扩增试剂准备区、标本处理区及PCR扩增检测区。 4.在标本处理阶段建议使用负压超净台。 5.应穿工作服，戴一次性手套（经常替换手套），使用一次性用品。 6.PCR操作人员应具有经验和受过培训。 7.操作过程中用到的超净台、移液器、离心机、扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或70%乙醇及紫外灯处理。 8.实验中废弃的吸嘴应弃于含10%次氯酸的废液缸中, 以防止污染。 9.阴性对照、工作标准品应和待检标本平行进行操作后方可进行PCR扩增。 10.使用本试剂盒检测，请按传染病实验室检查规程操作。 11.血清标本的测定结果比血浆标本测定结果略低。 实验三 丙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)-荧光定量检测 【原理与用途】 本品从血清或血浆中提取HCV RNA，在逆转录酶作用下将RNA逆转录为HCV cDNA，在引物的指导下，以四种脱氧核苷酸为底物，通过耐热DNA聚合酶的酶促作用，对cD