海参α-糖苷键水解酶与海参体壁自溶相关性研究-轻工技术与工程专业论文.docxVIP

青岛科技大学研究生学位论文海参0c．糖苷键水解酶与海参体壁自溶相关性研究 青岛科技大学研究生学位论文 海参0c．糖苷键水解酶与海参体壁自溶相关性研究 学位论文完成日期： 2015／6／9 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 篆卒 万方数据 青岛科技大学研究生学位论文海参0【．糖苷键水解酶与海参体壁自溶相关性研究 青岛科技大学研究生学位论文 海参0【．糖苷键水解酶与海参体壁自溶相关性研究 摘要 海参营养价值丰富，然而海参的自溶现象使海参营养流失严重，即使在热加工 过的海参在贮存、销售中也存在体壁劣化问题，因此寻找海参体壁自溶的影响因素 成为研究热点。本文则探究海参体壁中a．糖苷键多糖水解酶(以果胶酶为重点研究 对象)及其与海参体壁自溶的相关性。 首先比较了用于多糖水解酶活力测定的还原端基测定法，如DNS法、PAHBAH 法和MBTH法，结果表明，三种方法测得的标准曲线线性关系良好，其灵敏度MBTH 法最高，PAHBAH法次之，DNS法最低。由于PAHBAH法的显色产物稳定性较差， 不适合酶活力的大批量测定，而DNS法灵敏度过低，因此，选择MBTH法用于海 参体壁多糖水解酶活力的微量测定。 其次以仿刺参(Apostichopusjaponicus)为实验材料，利用机械匀浆、缓冲液浸 提、硫酸铵盐析、透析等分离方式从海参体壁中得到粗酶，发现具有果胶酶活力、 淀粉酶活力、甘露聚糖酶活力，其中果胶酶活力最高。偏碱性条件浸提更易得到较 高的果胶酶活力。以果胶为底物，研究粗酶中果胶酶的部分酶学性质，结果发现， 在pH7．0时，果胶酶活性最高，在pH3．0．10．0条件下保存4hr后，果胶酶活性均略 有升高，表明一定离子强度对果胶酶活力具有激活作用，且该酶耐酸碱性良好；在 900C时，果胶酶活力最高：在900C条件下保温20min前后活力无显著性变化，说 明该果胶酶耐强热，这对研究经热加工过的海参体壁在贮藏期内的体壁劣化机理具 有重要意义。 为了对上述所得粗酶进一步纯化，通过测定粗酶液的总带电情况，发现大部分 蛋白的等电点集中在pH4．40，因而选择阴离子交换柱层析，结果表明，当使用 DEAE一52弱阴离子填料时，果胶酶比活较高点集中在0．IM、0．2M的低NaCl浓度 交换洗脱峰中。为收集更多的果胶酶，改用Q．Fast Flow强阴离子填料，流动相pH 从7．0提高至8．0，但并没有收集到更多果胶酶，表明两种方法均可用于分离果胶酶。 电泳图的结果比较表明，海参体壁中的果胶酶分子量可能为280．288kDa。 分别研究了离子峰1(0．1MNaCl洗脱峰)和离子峰2(0．2MNaCI洗脱峰)的 酶学性质，结果表明，在酶解温度为900C和酶解pH为7．0时，离子峰l组分中果 胶酶活力最高，1000C保温20min后仍具有40％的活力，Ba2+、K+对该酶有明显的 万方数据 海参小糖苷键水解酶与海参体壁自溶相关性研究激活作用，Fe”、M92+、Zn2+对该酶有明显的抑制作用，Ca2+、Mn2+对该酶具有微 海参小糖苷键水解酶与海参体壁自溶相关性研究 激活作用，Fe”、M92+、Zn2+对该酶有明显的抑制作用，Ca2+、Mn2+对该酶具有微 弱的抑制作用，EDTA对可强烈抑制该酶的活性，表明该酶具备金属酶的性质。在 酶解温度为80。C和酶解pH为7．0时，离子峰2组分中果胶酶活力最高，在1000C 条件下保温20min，活力非降反升至原来的150％，Ba2+、Fe3+、Ca2+对离子峰2中 的果胶酶有明显的激活作用，M92+、Mn2+、K+对该酶有明显的抑制作用，Zn2+对该 酶基本没有抑制效果，EDTA可强烈抑制该酶的活性，表明该酶也具备金属酶的性 质。强热使其活力非降反升的原因有待于更深入的研究。 最后研究海参体壁果胶酶与海参自溶的相关性，以灭过酶的海参体壁组织为底 物分别以透析粗酶液、Q．Fast Folw阴离子交换洗脱酶液进行该底物的水解敏感性研 究，结果表明，上述具有果胶酶活力的酶液均可使海参体壁释放还原性物质；经过 强热处理的酶溶液不仅可提高果胶酶活力还可提高海参体壁还原性物质的增加速 率，而并不存在蛋白酶活力，即该酶水解海参体壁的能力与果胶酶活力的增加呈正 相关，而与蛋白酶活力无关。 关键词：海参果胶酶自溶相关性热稳定性金属酶 II 万方数据 青岛科技大学研究生学位论文STDUDIES 青岛科技大学研究生学位论文 STDUDIES ON RELATIV【TY BETWEEN O【．GLUCOSIDIC BOND HYDROLASE FROM SEA CUCUMBER AND AUTOLYSIS 0F SEA CUCUMBER BODY WALL ABSTRACT The cucumber was rich in nutrition，b