海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用-海洋生物学专业论文.docx

fIllll fIllll IIII II I PIII III III Y1 928425 海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用 学位论文完成日期：至Q!!生兰且至主旦 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： 「 独创声 独创声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 或其他教育机 构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者虢囊也奇签字魄砂 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本 人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信 息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会 公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 导师签字： 学签 位字 论日 文期 ㈣协者沙 名年 瑗～ 侈归匀， 签字日期： 峙驯 扩日 签J 、 海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用摘要 海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用 摘要 目前普遍认为海洋微生物能被分离培养的还不到1％，如何快速大量地从海 洋环境中获得微生物纯培养成为该学科研究的“瓶颈”。研究发现，经典的平板培 养方法不适合于大多数海洋微生物的培养，今后海洋微生物学领域的重要课题之 一就是寻找难培养海洋微生物的培养方法。为建立海洋微生物的新的分离培养技 术，本论文按以下研究内容展开：包埋活细胞的微球制备技术的建立、海洋微生 物高通量培养和分选方法的建立与应用以及一株海洋新菌的分类鉴定。 本论文以活细胞的微包埋为前提，建立了三种微球制备方法，分别为搅拌 乳化法、两相共流法和膜乳化法。三种方法均可以采用多种天然高分子聚合物(如 琼脂糖、褐藻酸钠和结冷胶)制备出粒径均一的微球，其制备工艺简单、条件温 和，适合活生物细胞的包埋。所建立的微球制备技术也可应用于其它领域。 在所建立的微球制备技术基础上，进一步建立了海洋微生物的高通量培养 和分选技术。该技术的基本步骤是，首先采集海洋微生物样品，采用离心和滤膜 过滤法浓缩微生物，将浓缩的微生物细胞进行微包埋；然后将包埋有微生物的微 球装层析柱，模拟微生物的原生态环境，在寡营养条件下对包埋微生物进行流动 培养；随后用流式细胞仪对长有微菌落的微球进行分选，并对分选后的微菌落加 入营养丰富的海洋培养基继续培养；最后对分离纯化的菌株进行保藏及分类鉴 定。通过对一株纯培养细菌及两个海洋样品的包埋、培养、分选和鉴定，验证了 该方法的可行性，可有效提高海洋微生物的可培养性。该技术采用所建立的三种 适合活细胞包埋的方法，尤其是两相共流法和膜乳化法，改善了微生物的包埋条 件，可更好的保证细胞的存活率；该技术除了采用琼脂糖为包埋材料外，还采用 海藻酸钠和结冷胶作为包埋材料对微生物进行包埋，包埋基质的不同可能会增加 微生物的可培养性；此外，本技术还增加了微生物的包埋数量，可使微生物问的 交流更加密切，有助于提高微生物的可培养性。 利用高通量培养分选法和平板分离法分析了极地底泥样品和青岛文昌鱼繁 殖区海水及沉积物样品的微生物多样性。用高通量法共分离并保藏菌株500株， 其中极地样品350株，文昌鱼繁殖区样品150株；利用平板分离法共分离菌株 其中极地样品350株，文昌鱼繁殖区样品150株；利用平板分离法共分离菌株 254株，其中海水样品213株，沉积物样品37株。 对47株高通量法分离极地菌株1 6S rDNA序列分析结果显示，这些菌株来 自6个细菌类群：a一变形菌纲(19)、p-变形菌纲(2)、丫一变形菌纲(1 7)、放线菌r1(2)、 厚壁菌f-J(4)和拟杆菌f-J(3)，共21个属，其中有6株为潜在的海洋细菌新种(16S rDNA序列与已知细菌的相似性小于97％)，均来自副球菌属。 对80株高通量法分离的文昌鱼繁殖区海水样品菌株的分析结果显示，分离 菌株属于7个细菌类群，分别为a一变形菌纲(26)、丫一变形菌纲(35)、拟杆菌门(9)、 放线菌门(4)、厚壁菌门(4)和稀有类群￡一变形菌纲(1)和疣微菌门(1)，共41个属， 其中13株为潜在的细菌新种。对70株平板法分离文昌鱼繁殖区海水样品菌株的 测序结果表明，这些菌株来自4个细菌类群，分别是丫．变形菌纲(57)、(It．变形菌 纲(6)、拟杆菌rl(2)和厚壁菌rl(5)，共26个属，其中3株为潜在的细菌新种。