固定化肌酸激酶连续制备分离磷酸肌酸-药物化学专业论文.docxVIP

重庆大学硕士学位论 重庆大学硕士学位论文 目 录 PAGE PAGE IV 目 录 中文摘要I 英文摘要 II 1 概 述 1 1.1 磷酸肌酸的用途 1 1.2 固定化酶研发现状 2 1.2.1 固定化酶技术简介及优点 2 1.2.2 固定化酶方法及固定化酶载体的研究现状 3 1.3 本课题的选题背景及意义 6 2 实验原理 8 2.1 制备固定化肌酸激酶原理 8 2.2 肌酸激酶的催化机理 8 2.3 离子交换分离磷酸肌酸的原理 8 2.4 固定化酶反应-磷酸肌酸分离耦合原理 10 2.5 高效液相色谱法 10 2.6 红外光谱 11 2.7 核磁共振 12 3 实验仪器及试剂 13 3.1 实验仪器 13 3.2 实验试剂 14 4 实验方法 15 4.1 赖氨酸修饰交联壳聚糖微球 15 4.1.1 制备交联壳聚糖树脂 15 4.1.2 制备交联壳聚糖-赖氨酸树脂 15 4.2 固定化肌酸激酶的制备 16 4.2.1 试剂配制 16 4.2.2 制备肌酸激酶 16 4.2.3 制备固定化酶 16 4.2.4 固定化酶活力测定 17 4.2.5 肌酸激酶动力学参数的测定 18 4.3 磷酸肌酸的制备与分离 18 4.3.1 选择阴离子交换树脂 18 4.3.2 静态交换 19 4.3.3 洗脱实验 20 4.3.4 动态交换 20 4.3.5 制备磷酸肌酸 20 4.4 磷酸肌酸钠的精制 21 5 结果与讨论 22 5.1 制备固定化肌酸激酶的优化工艺 22 5.1.1 pH 值的影响 22 5.1.2 交联时间 23 5.1.3 酶摩尔用量比 24 5.1.4 戊二醛与载体游离氨基摩尔比 25 5.2 固定化酶酶学性质 27 Km 值 27 最适 pH 28 5.2.3 最适反应温度 29 5.2.4 重复使用稳定性 30 5.2.5 热稳定性 31 5.2.6 贮存稳定性 32 5.3 固定化酶反应器连续反应生成磷酸肌酸的优化工艺 33 5.3.1 离子交换树脂的选择 33 5.3.2 底物浓度对反应的影响 34 5.3.3 流速对反应的影响 35 5.3.4 连续制备磷酸肌酸 36 5.3.5 柱式动态洗脱 36 5.4 磷酸肌酸钠的分离纯化 37 5.5 连续合成、分离磷酸肌酸工艺的耦合性的主要参数 38 5.6 磷酸肌酸钠的表征 40 5.6.1 核磁共振谱图分析 40 5.6.2 红外谱图分析 41 5.6.3 高效液相色谱 42 6 结 论 43 致 谢 44 参考文献 45 附 录 50 A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录 50 B. 作者在攻读硕士学位期间取得的科研成果目录 50 重庆大学硕士学位 重庆大学硕士学位论文 1 概 述 PAGE PAGE 10 1 概 述 磷酸肌酸（phosphocreatine,CP）是一种在 1927 年就从哺乳动物肌肉中分离得 到的、参与细胞能量代谢的高能磷酸化合物[1]。直到 50 多年后，人们才了解了它 的生理功能[2]。首先，它是维持高耗能细胞内能量（ATP）浓度的缓冲剂-高能磷酸 键贮存形式，避免 ATP 供应浓度的波动；其次，它作为细胞的能量载体，将线粒 体所产生的能量从产生部位转移到消耗部位。磷酸肌酸在体内的生物合成从肾脏 开始，先经甘氨酸与精氨酸反应形成胍基乙酸，再运送至肝脏发生甲基化反应， 生成肌酸，最后输送到各组织中，经磷酸化形成磷酸肌酸[3]。随后药学专家对其进 行了化学合成，并将其制成钠盐用于临床。磷酸肌酸二钠盐可在乙醇水溶液中结 晶，其晶形为含六分子结晶水的六边形结晶体，在真空干燥操作下，该结晶体转 变为含四分子结晶水的针状结晶体。该晶体水溶性好，稳定，在 4℃干燥状态下放 置一年无分解现象[4]。其结构式如图 1.1 所示： 图 1.1 四水磷酸肌酸二钠盐结构式 Fig.1.1 The structure of Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate 1.1 磷酸肌酸的用途 合成磷酸肌酸一般常用化学合成法[16]和生物酶法[17]，公开的文献资料极少。 目前，合成磷酸肌酸的化学法只有一种，即碱性 POCl3 法，仅有 2 个科研团队成 功获得磷酸肌酸。Karl Zeil 和 Gerorge Fawaz 首次合成磷酸肌酸[18]。他们将①肌 酸与 POCl3 混合于低温碱性溶液中进行反应；②反应完成后在 0℃下过滤，除去 磷酸钠沉淀；③滤过液用盐酸调节至微碱性，在室温下真空浓缩，过滤除去肌酸； ④再加入 MgCl2