冠脉转染Nrf2基因对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及机制的研究-麻醉学专业论文.docxVIP

原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： al原磁 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 日期：—竺．至年．旦月兰日 博+学位论文 博+学位论文 中文摘要 摘要 目的：(1)．构建携带人Nrf2基因的腺病毒载体；(2)．研究冠脉途 径腺病毒载体转染Nrf2基因到心肌的可行性，如果可行观察其对缺 血再灌注心肌的影响；(3)．研究Nrf2基因保护缺血再灌注心肌的可能 机制。 方法：(1)．构建包含Nrf2的重组腺病毒：采用分子克隆手段获得 携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组质粒、携带Nrf2的重组 质粒，以细胞内同源重组法构建重组腺病毒Adv—EGFP、Adv-Nrf2， 在293细胞内分别扩增，按Adeno．ⅪM Virus Purification Kit(BD Biosciences，Clontech)的步骤纯化病毒。经纯化的病毒滴度分别为， Adv．EGFP：1X1012(PFU／mL)、Adv-Nrf2：1X1012(PFU／mL)。根据预 实验结果，确定实验使用最佳Adv．EGFP、Adv-Nrt2滴度为1×10， (PFU／m1)，用量为O．1mi。 (2)．40只SD大鼠随机分成4组(n一10)。大鼠左侧开胸，暴露心尖部 及主、肺动脉根部，用10号线于主、肺动脉根部阻断循环，同时用27 号针头于心尖部注入0．1ml各组相应试剂至左心室腔，使之在密闭的 冠脉循环内分布，10秒后松开lO号线。其中第1、II、Ⅲ组注射0．1ml 空病毒载体；第1V注射0．1ml含Adv-Nrf2的重组腺病毒。关胸苏醒后， 稳定3天，使经冠脉转染的基因充分表达于心肌。 (3)．冠脉转染3天后，再次暴露胸腔，在左心耳与肺动脉圆锥之间 结扎心大静脉及冠状动脉左前降支(LAD)。结扎30min后，松开缝线 使冠状动脉再通120min。I组只穿线不结扎。ⅡI组在LAD结扎5min后 开放5min，并重复3次，然后再行30min缺血、120min再灌注。 (4)．采用BL．420F系统全程监测所有动物心电活动及平均动脉压； 采用Evan’s Blue和TTC双染色法测定心肌梗死面积：光学显微镜下观 察心肌的炎症改变；电镜下观察心肌超微结构的改变；硫代巴比妥酸 法测定心肌组织MDA的含量；黄嘿吟氧化酶原理测定心肌组织SOD 活性；酶联免疫吸附试验测定心肌组织TNF．a的含量；Western Blotting 免疫印迹测定Bcl．2及Bax蛋白表达的改变；原位末端标记法(TUNEL) 检测心肌细胞凋亡等。 结果：(1)．HR、MAP、心律失常及心肌梗死面积的观察：各组大 鼠HR、MAP在基础状态时无明显差异；缺血再灌注后后，胍在T3、 T5、T6时下降较明显(P0．05)；MAP则在T1、13、T4、T5、T6时下 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 降较明显(PO．05)；各组心律失常发生率均明显增高(PO．05)：而ⅡI组、 IV组HR、MAP及心律失常发生率明显好于II组。II、ⅡI、IV组心肌 梗死面积分别为(37．64-1．9)％、(264-1．5)％、(26．64-1．O)％。与II组比较， ⅡI、Ⅳ组能明显的降低心肌梗死面积(PO．05)。 (2)．心肌酶学与肌钙蛋白的观察：I／R后，各组LDH、CK、CK．MB、 cTnI均明显升高(PO．05)，III、IV组与II组比有统计学意义(PO．05)； Ⅳ组CK、CK．MB比III组升高更为明显伊O．05)。 (3)．光镜及电镜观察：光镜下II组呈现心肌损伤病理改变，可见 细胞水肿、排列紊乱、心肌纤维断裂、大量红细胞及中性粒细胞浸润 等；而ⅡI、Ⅳ组病理损伤程度较II组明显减轻。电镜