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肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌细胞中表达初步探究 【摘要】目的：研究肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺 腺癌中的表达，探讨XAF1在肺腺癌耐药发生、发展中的作 用，为基因治疗耐药肺腺癌提供理论依据。方法：本研究培 养人非小细胞肺癌顺钳耐药细胞株A549/DDP和其亲本株 A549,通过MTT法测定A549/DDP对顺钳的耐药指数；采用 半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测两种细胞及 凋亡细胞（顺铀作用48h后的A549细胞）中XAF1、XIAP mRNA 的表达水平变化。结果:A549和A549/DDP细胞对顺铀的IC50 分别为 5. 52±0. 12?mol/L. 34. 96±0. 74?mol/L,因此, A549/DDP对顺铀的耐药指数为34. 96/5. 52=6. 33,确定为耐 顺铀的非小细胞肺癌细胞；RT-PCR结果显示A549/DDP细胞 较正常A549细胞XAF1 mRNA表达水平下调（P A549/DDP 细胞对DDP的耐药指数二顺钳对A549/DDP细胞的IC50/顺钳 对其亲本敏感细胞株A549细胞的IC50,即34. 96?mol/L /5. 52?mol/L=6. 33O所以A549/DDP细胞确定为耐顺钳的肺 癌细胞株，适合进行进一步的肺癌耐药相关机制研究。 表1顺铀对A549细胞的增殖的影响（x土s, n=6） 浓度 0?mol/L 1.25?mol/L 2.5?mol/L 5?mol/L 7. 5?mol/L 10?mol/L 0D 值 l?013±0?012 0. 901±0. 016 0. 800±0. 025 0. 473±0. 017 0. 302±0. 014 0. 087±0. Oil IR (%) 0 11.04±0. 02 21.01±0. 03 53. 33±0. 02 70. 19±0. 02 91.41±0. 01 表2顺铀对A549/DDP细胞的增殖的影响(x±s, n=6) 浓度 0?mol/L 10?mol/L 20?mol/L 30?mol/L 40?mol/L 50?mol/L 0D 值 1. 041±0. 015 0. 851±0. 008 0. 705±0. 016 0. 582±0. 013 0. 383±0. 017 0. 265±0. 016 IR (%) 0 18. 25±0. 01 32. 26±0. 02 44. 09±0. 01 63. 20±0. 02 74. 55±0. 02 二、RT-PCR 检测 A549 及 A549/DDP 细胞的 XAF1、XIAP mRNA表达情况 RT-PCR结果显示：A549/DDP细胞组较正常A549细胞组 XAFl mRNA表达水平下调(P 【关键词】人肺腺癌顺钳 耐药细胞株A549/DDP； XIAP相关因子1；细胞凋亡 【中图分类号】R655【文献标识码】A【文章编号】 1004-7484 (2013) 03-0038-02 材料与方法 一、材料 人非小细胞肺癌A549细胞株属我院实验室保存，来源 于中国科学院上海细胞生物学研究所；人非小细胞肺癌耐顺 铀细胞株A549/DDP细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中 心（北京大学肿瘤临床学院建系，其亲本细胞A549来源于 ATCC）； DDP购自山东齐鲁制药有限公司（10mg/支，批号 ；四甲基偶氮口坐蓝（MTT） （Sigma 公司）；Trizol 试剂（Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（Fermentas公司）; 特异性引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。 二、方法 1细胞培养人非小细胞肺癌A549细胞培养在DMEM（含 10%小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）培养液中， 人非小细胞肺癌耐顺钳细胞株A549/DDP细胞培养在含有 2mg/L DDP的DMEM培养基中，置37°C、饱和湿度、含5%C02 和95%空气的恒温培养箱中培养，隔2-3天换液一次，定期 传代，进行试验前1周更换为不含DDP的DMEM培养基以减 少DDP对实验的干扰，全部实验均采用指数生长期的A549 细胞和A549/DDP细胞。 2 MTT法测定A549/DDP细胞的耐药指数取对数生长期 的A549和A549/DDP细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞密度 接种于无菌96孔板中，每孔200ul （细胞数约为5X103）o 每组设6个复孔。根据预实验结果，A549细胞分别加入DDP 终浓度为 0?mol/L. 1. 25?mol/L. 2. 5?mol/L. 5?mol/L. 7?5?mol/L、10?mol/L 的 DMEM 培养基,A549/DDP 细胞分别 加入 DDP 终浓度为 0?mol/L. 10?mol/L