含硫肽类抗生素基因工程的分析-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

复旦大学博士论文 复旦大学博士论文 中文摘要 含硫肽类抗生素基因工程的研究 中文摘要 本论文研究内容包括两个部分，第一部分为克莱博氏菌青霉素G酰化酶基因 工程的研究；第二部分为那西肽产生菌活跃链霉菌(Slreptomyces．actuosus)基因工 程的研究。 第一部分 1932年，英国科学家弗来明发现了青霉素。它高效广谱的抗菌效果使之在 临床上被广泛使用。然而伴随着青霉素日益广泛甚至过度的使用，导致了抗性病 原体的产生。利用新型半合成抗生素是克服这种抗性病原体产生的唯一方法。半 合成抗生素具有较少副作用、较小毒性、有较大的抗病原专一性、较宽抗菌谱和 较好的药理学活性而主导着世界抗生素市场。青霉素G酰化酶(penicillin G aeylase，PGA，EC 3．5．1．11)能水解青霉索G产生6．氨基青霉烷酸(6．APA)，6-APA 是半合成青霉素的关键中间体：另外，作为生物催化剂，PGA在许多有潜在价 值的反应中也发挥了重要作用，例如多肽合成中保护氨基和羟基；PGA还可应 用于氨基酸、B．氨基酯、胺类等手性化合物的拆分。拆分得到的纯的对映异构体 可用作合成有生物活性组分的中间体。现已在许多微生物体内发现有该酶存在， 如各种细菌、放线菌、真菌和酵母等。虽然大肠杆菌的PGA是工业应用上最为 重要的来源，但开发和应用其他来源的PGA也取得了令人鼓舞的成果。与大肠 杆菌的PGA相比，来自克莱博氏菌的青霉素G酰化酶具有对温度、pH的耐受 性，与有机溶剂的共溶性，而且易固定化等优点。然而，到目前为止，对来自克 莱博氏菌青霉素G酰化酶的研究还主要集中于分子特性以及底物特异性的研究， 系统地利用基因工程技术、发酵工程技术来研究和开发此酶在工业生产上的应用 还未见报道。因此，本研究曹次以来自克莱博氏菌青霉素G酰化酶为研究对象， 利用DNA重组技术将编码克莱博氏菌青霉素G酰化酶基因克隆入质粒pET28b， 获得一个C端含6个组氨酸的融合蛋白表达载体pETKcPGA。在LB培养基中， 蔓旦大学博士论文 蔓旦大学博士论文 中文摘要 IPTG诱导浓度为59M，此融合蛋白在E．coli BL21(DE3)成功表达。利用Ni．IDA 层析柱可一步纯化此融合蛋白，获得比活力达35．3U／mg，得率为89％。酶学性 质测试发现，该重组酶在pH5．0—10．0以及温度5．40℃范围，活性稳定。它的最 适反应pH和温度分别为8．5和55℃；Kin和Vrnax分别为17．611M．和23．8U／mg。 此项工作还研究了环境条件(特别是温度和pH)和培养基组分对克莱博氏菌青 霉素G酰化酶异源表达的影响。在先前研究工作的基础上，优化出高表达和过 量生产KePGA的最佳条件：利用TB培养基，甘油含量为2．59／L，28*(2培养24 小时，无需IPTG诱导即可大量表达KcPGA，250ml摇瓶50ml培养基培养酶活 高达15，000U／L。同时，探讨了重组工程菌的稳定性，在无抗性筛选的情况下， 此重组菌连续传代15次，相对酶活稳定在90％以上。这是迄今为止第一次有关 利用DNA重组技术，过量生产KcPGA的报道。 关键词：青霉素G酰化酶、克莱博氏菌、酶学性质、发酵优化 复旦大学博士论文 复旦大学博士论文 中文摘要 第二部分 那西肽(Nosiheptide，又称Mulfithiomycin)是一种高度修饰的含硫多肽类抗 生素，由活跃链霉菌Streptomyces．actuosus(Streptomyces 40037，S．actuosus)产 生。1961年首先由法国Rhonepoulenc S．A发现，以后美国、法国和日本的科学 工作者都对它的产生、生物合成和应用开展了多方面的研究。那西肽是一种微黄 色结晶，较难溶于水，它对革兰氏阳性菌有明显的抑菌作用，但由于其水溶性极 差，尚未用于人类临床，然而它却是一种迄今为止最好的动物饲料添加剂，能促 进动物的生长，提高饲料利用率，增强动物的抗病能力，且在动物体内无残留。 法国、日本己开发生产作为动物饲料添加剂。我们实验室从1988年即开始对那 西肽进行研究，先后获得上海市科