寡核苷酸芯片检测乙型肝炎病毒基因突变的应用研究-免疫学专业论文.docx

导师介绍曲迅，女，1958年11月出生，免疫学硕士，教 导师介绍 曲迅，女，1958年11月出生，免疫学硕士，教 授。现任山东大学齐鲁医院基础研究所所长。主要从 事肿瘤免疫及中西医结合抗肿瘤转移方面的研究。 学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。 文中引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意 义上己属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的 论文或成果。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东省 医学科学院。山东省医学科学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅 以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的 学术论文或成果时，署名单位仍然为山东省医学科学院。 论文作者签名：董圭 日期：生堕年—』月jL日 导师签名：盘 日期：逆! 年。L月—墨日 冒冒山东省医学科学院研究生毕业论文寡核苷酸芯片检测乙型肝炎病毒基因突变的应用研究 冒冒山东省医学科学院研究生毕业论文 寡核苷酸芯片检测乙型肝炎病毒基因突变的应用研究 专业：免疫学 研究生：黄宁 导师：陆迅 教授 中文摘要 乙型肝炎病毒在自然状态或药物诱导+F常出现基因变异情况，越来越多的研究资料 表明，HBV基因序列的变异与异常的血清学现象、免疫预防失败、致病性的改变以及临 床耐药性的产生密切相关。 本课题的研究目的是通过自行设计、制作检测乙型肝炎基因突变的寡核苷酸芯片， 观察Imsag和HBVDNA定量阳性的慢性乙型肝炎病人HBV前C区及BCP区基因突变 情况，探讨HBV前C区及BCP区基因突变在乙肝病情发展、转归中的作用及基因芯片 检测方法在此领域的应用前景。本课题的研究内容主要包括寡核苷酸芯片的设计和制作、 利用制作的芯片对慢性乙型肝炎病例的检测及结果分析等内容。 首先，根据Genebank上的HBV基因组序列，利用相关软件设计、合成了制作芯片 的寡核苷酸探针及用于扩增目的基因的引物，探针包括针对HBV序列前c区1896、1899 位核苷酸位点的野生探针和突变探针；针对BCP区1762、1764位点的野生探针及双突 变探针。然后对作为芯片载体的玻片进行了醛基化处理，使用全自动点样仪将合成的探 针按设计的阵列点在处理好的玻片上，点样后的玻片通过一系列处理，使靶基因牢固的 固定于玻片表面，并阻断非特异性位点，以提高杂交效率。 选取临床60例慢性乙型肝炎病人，对其进行各项肝炎指标、肝功能和HBVDNA定 量测定的同时，用自制的基因芯片对其乙型肝炎病毒前C区、BCP区基因突变情况进行 TN定，测定过程包括：采用酚／氯仿／异戊醇法提取乙肝病毒DNA；用设计的引物采用 不对称PCR法扩增包括I-IBV前C区、BCP区的目的片段，并同时用随机掺入法对扩增 片段甩Cy5进行荧光标记；标记好的扩增片段与制备好的寡核苷酸芯片进行杂交；用激 光共聚焦芯片扫描仪对各杂交点的荧光信号位置、荧光强弱等大量数据信息进行采集， LMAGENE3．0分析Cy5荧光信号的强度和比值进行结果判断；随机选取20例基因芯片 阳性标本进行了基因序列测定。结果显示：①60例I-msAg和HBVDNA定量阳性的慢性 乙型肝炎病人基因芯片法检测显示54例阳性，阳性率为90 o％，最低检测灵敏度为 1×104copy／ml；②对于非混合株感染病例，基因芯片检测法与测序法相比较，符合率为 100％，对于混合株感染病例，二者符合率仅为15．4％，测序法远远低于基因芯片检测法； 2 l淘山东省医学科学院研究生毕业论文③在54例基因芯片检测阳性的病例中，HBeAb阳性和e系统阴性组与I-meAg阳性组比 l淘山东省医学科学院研究生毕业论文 ③在54例基因芯片检测阳性的病例中，HBeAb阳性和e系统阴性组与I-meAg阳性组比 较，t-IBVDNA定量结果无显著性差异；在BCP区联合突变及前c区、BCP区多点突变 方面有极显著性差异(p0．01)，在前C区1896位点突变方面有显著性差异(pO．05)； ④54例基因芯片检测阳性的病例中前c区1896位突变组及多点突变组与未突变异组相 比，ALT、AST、BIL检测结果具有极显著差异(pO．01)，前C区1899位突变组及BCP 区双突变组与未变异组相比ALT、AST及BIL检澳9结果也有显著差异(po 05)，各变异 组问三项指标相比较差异无显著性；⑤54例基因芯片检测阳性的病例中，慢性乙型肝炎 轻度、中度和重度组前C区和BCP区各位点突变率相比较无显著性差异。 通过上述测定及统计学分析我们得出以下结论：①乙型肝炎病毒前c区(主要是1896