活版印刷基因芯片系统平台及启动子甲基化芯片的研究-生物信息物理学专业论文.docxVIP

IlYllllIIilllllll9llIilllllllll811111151111110llllll7llUl IlYllllIIilllllll9llIilllllllll811111151111110llllll7llUlY1 91 8507 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 ～ 作者签名： 摩天 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：崔立导师签名蟛吼迎年坳2日 博士学位论文 博士学位论文 摘要 摘要 基因芯片已被广泛运用到生物诊断、生物表达、生物组、疾病诊 断、药物筛选、发现新基因及各种病原体的诊断等生物科学领域中的 重大应用价值，其光芒已渗透到生命科学的各个领域，成为后基因组 时代科学研究强有力的工具。近年来，国外以Illumina、Affymetrix、 Agilent、Roche．Nimble Gen等公司推出了各种基因芯片合成系统平 台，虽然能够完成基因芯片的自动化操作，但由于其均需要了芯片及 相关试剂和试剂盒、工具数据库及芯片分析软件工具、芯片制备系列 平台仪器及其零配件、扫描检测仪器、杂交反应设备，使得价格普遍 在数百万人民币以上，且其合成芯片技术都存在着专利保护，合成的 基因芯片价格高昂，目前国内生物芯片产品主要用户为规模较大的科 学研究单位，市场空间相对单一狭小，规模较小科研院所都负担不起， 造成了基因芯片难以临床应用和推广的瓶颈。因此，研制和开发一种 具有自主知识产权，又能快速、准确、低成本的基因芯片合成系统平 台非常重要。 本研究基于自主创新的活版印刷基因芯片(DNA微阵列)原位 合成的技术，研制了一种成本低廉、质量可靠、工艺简单、特别适合 于产业化的基因芯片合成仪，构建活版EN,N原位合成基因芯片系统平 台，制备了甲基化特异性寡核苷酸芯片。具体内容包括： 1．活版印刷原位合成基因芯片合成仪 根据活版印刷法合成DNA微阵列的原理，本文设计和加工活版 印刷原位合成基因芯片合成仪，并采用三坐标仪对模板、反应槽底座 精度、模板和底座组装后各位置公差以及二维定位系统的精度进行检 测，结果表明：模板精度和反应槽底座精度均为39m，模板和底座组 装后各位置公差小于81．tm，X轴的重复精度为8．8I．tm，定位精度为 14．4pm；Y轴的重复精度为9pm，定位精度为151am，能符合活版印 刷法制备基因芯片的要求。 2．构建活版印刷基因芯片合成系统平台 本文以活版印刷DNA合成仪器为核心，结合无水无氧专用手套 箱、分子杂交仪、荧光扫描仪构建了活版印刷基因芯片合成系统平台， 并采用完全正交回归实验研究了反应槽中碱基单体的体积，压印平台 的压印时间，机械手压印时的气体压力对活版印刷基因芯片原位合成 博士学位论文 博士学位论文 摘要 系统芯片合成效率的影响。研究表明：压印时间为45s，碱基单体体 积为1200ul，气体压力为O．12MP为系统平台最优的合成条件，基因 芯片压印效果为100％。本文运用上述合成条件和活版印刷基因芯片 合成系统平台，成功研制出了p53基因第四外显子72密码子单碱基 突变寡核酸微阵列，各阵点上同一探针寡核苷酸的杂交荧光强度均匀 一致，实现了单个碱基正错配的检测。 3．肺癌甲基化特异性寡核苷酸芯片制备及验证 本文采用活版印刷基因芯片合成系统平台，研制了RARB、FHIT、 RASSFlA基因启动子甲基化特异性寡核苷酸芯片，在肺癌患者和正 常人群进行高通量的平行检测，并采用MSP方法扩增FHIT、RARB、 FASSlA基因启动子，验证甲基化芯片的正确性。研究结果表明：芯片检测 结果与MSP方法检测结果在统计学上差异不显著(p0．05)，甲基化特异 性寡核苷酸芯片是一种低成本、质量可靠、高灵敏度、高特异性的基 因芯片，能应用于临床分析；其活版印刷基因芯