基质金属蛋白酶-2的基础与临床研究-内科血液学专业论文.docxVIP

基质金属蛋白酶．2的基础与l临床研究 基质金属蛋白酶．2的基础与l临床研究 中文摘要 中文摘要 基质金属蛋白酶．2(MMP一2)是由Huhtala P等人在1990年克隆表达的，其结构中 含有信号肽、前肽、催化区、纤维连接蛋白样区域及血红素结合样区域。人类MMP一2 基因编码分子量约72kd的酶原，经活化后水解为65kd的活性形式。MMP．2是降解细 胞外基质骨架蛋白Ⅳ型胶原主要酶之一，其生理功能主要是参与伤口愈合，生殖以及生 殖器官的复旧等。研究发现MMP．2与肿瘤的侵袭和转移、自身性疾病自身免疫性疾病、 牙周疾病以及肿瘤组织的血管生成密切相关。鉴予MMP．2的重要病理生理功能，本研 究旨在基础和临床两方面对MMP．2的功能作进一步探讨。通过在体外表达MMP-2所 特有的结构域，我们制各出抗MMP．2的特异性单克隆抗体，利用所制备的单克隆抗体 初步建立了检测血清／浆MMP-2水平的试剂盒，并且对正常人及良恶性肿瘤病人血清 MMP．2水平进行了测定和比较，这为检测MMP-2提供了一个有效的工具：运用RNA 干扰(RNAi)技术对MMP．2基因进行基因沉默，更进一步揭示了MMP．2的功能及可 能的作用机ItIJ；同时对基质金属蛋白酶在慢性粒细胞性白血病，这一特殊类型的肿瘤中 的作用进行了初步探讨。 1．MMP．2单克隆抗体制备及功能研究 目前发现的基质金属蛋白酶所有成员的结构中都含有三个共同的结构域：1催化区 2氨基端3羧基端。此外基质金属蛋白酶．2(MMP．2)还有一个特有的区域，即纤维连接 蛋白样区域，研究认为它所参与形成的空间结构决定MMP．2与底物的连接，只有首先 与底物连接，进而才可能发挥酶的活性作用。因此，这一环节的阻断。对抑制内皮细 胞和肿瘤细胞的侵袭和转移等有重要意义。 我们根据Gerd3ank中MMP-2eDNA序列设计引物，体外培养EAhy926内皮细胞， 收集细胞后抽提总RNA，利用所合成引物经RT-PCR获得纤维连接蛋白样片段eDNA， 与pET20b(+)表达载体重组后转化大肠杆菌BL21(DE3)plus，挑选阳性克隆后，经IPTG 诱导表达蛋白。蛋白经次氮基三乙酸镍琼脂糖(Ni-NTA agarose)柱纯化浓缩后免疫 Balb／c小鼠，尾静脉加强后取脾细胞融合，ELISA法筛选阳性克隆，制备腹水。运用 Westem blot对抗体进行鉴定，并观察抗体与天然MMP．2及纯品的反应情况。进行亚型 鉴定．组织特异性鉴定同时进行功能实验：增殖实验、侵袭实验以及体外血管新生实验。 结果显示：原核表达MMP一2纤维连接蛋白样片段大小为21kd，表达量占菌体总蛋白 25％，经Ni．NTA agarose柱纯化后，获得了部分纯化的蛋白。小鼠脾细胞与杂交瘤细 莓质金属蛋白酶．2的基础与临床研究 莓质金属蛋白酶．2的基础与临床研究 中文摘要 胞融合后筛选获得二株持续分泌单克隆抗体的细胞株，命名为SZ一116和SZ一117。两株 杂交瘤细胞单克隆后接种小鼠腹腔产生腹水，间接ELISA法；煲l|定其效价分别为l×104 和2×10一。琼脂糖双扩散法显示两株抗体皆为IgGl亚类。腹水经蛋白G．Sephrose4B 亲和层析柱纯化后浓度分别为1．8mg／ml和1．5mg／ml。单抗SZ-116和SZ．117能够与细 胞膜打孔后的血小板反应，而不与未经打孔的血小板反应。它们与打孔前后的白细胞 和红细胞皆不能反应。两株单抗均能够识别相对分子量为21kd的重组蛋白且能够特异 性地识别非还原条件下EAhy926细胞裂解液中分子量约72kd的蛋白及大小为69kd的 重组酶原。免疫组化提示：胃、胆囊、脾脏、卵巢、前列腺、输卵管以及淋巴结的间 质中都有阳性表达，而在甲状腺、小肠、肝脏等组织器官未见阳性表达。 运用MTT比色法测定经不同浓度sz-117作用后EAhy926细胞及胰腺癌细胞1990 的增殖能力，结果显示，与对照组比较，各组光密度值变化无统计意义差别。内皮细 胞及胰腺癌细胞与Sz-117作用后在两种趋化因子作用下的迁移能力均受到抑制，且对 COLIV的抑制作用强于Fn，侵袭实验也有相似的结果。内皮细胞体外的血管形成能力 在经SZ．117作用后