基质金属蛋白酶和miR99a在卡波西样血管内皮瘤中作用机制的研究-儿科学专业论文.docxVIP

重庆医科 重庆医科大学博士研究生学位论文 万方数据 万方数据 基质金属蛋白酶和 miR99a 在卡波西样血管内皮瘤中 作用机制的研究 摘 要 第一部分 基质金属蛋白酶和微小核糖核酸 99a 在卡波西样 血管内皮瘤中表达情况的研究 目 的 ： 探 讨 卡 波 西 样 血 管 内 皮 瘤 中 （ kaposiform haemangioendothelioma ， KHE ） 基 质 金 属 蛋 白 酶 （ matrix metalloproteinase，MMP）和微小核糖核酸（micro ribonucleic acid， microRNA）相互作用。 方法：收集重庆医科大学附属儿童医院 2004 年至 2013 年间 29 例 卡波西样血管内皮瘤病人标本。所有病例均经过病理学及临床确诊。 运用免疫组化、逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白质印记 (Western blot)检测 KHE 病人标本中 MMP3、MMP7、MMP9、MMP13 和微小核糖核酸 99a（miR99a）的表达，使用双变量相关分析分别计算 MMPs 和 miR99a 之间的相关系数。 结果： KHE 标本中通过免疫组化、RT-qPCR、Western blot 三种 方法检测到 MMP7、MMP9、MMP13 的表达，但没有检测出 MMP3 的表达。我们发现基质金属蛋白酶 7 与 MiR99a 的表达水平有显著意义 的相关性（r=0.76; P0.001），基质金属蛋白酶 13 与 MiR99a 的表达水 平也有显著意义的相关性（r=0.81; P0.001），而基质金属蛋白酶 9 的 重庆市自然科学基金（cstc2012jjA0197） 1 水平与 MiR99a 的表达水平没有相关性（r=0.0052; P=0.96）。 结论：基质金属蛋白酶和微小核糖核酸与卡波西样血管内皮瘤的 肿瘤发生有关。卡波西样血管内皮瘤中微小核糖核酸 99a 与基质金属 蛋白酶 7 和基质金属蛋白酶 13 有密切相关性，与基质金属蛋白酶 9 没 有相关性。 关键词： KHE，MMPs，microRNA，肿瘤发生 2 第二部分 微小核糖核酸 99a 通过调节基质金属蛋白酶 7 和 基质金属蛋白酶 13 控制卡波西样血管内皮瘤的侵袭性的研究 目的：进一步探索基质金属蛋白酶 7 和基质金属蛋白酶 13 通过微 小核糖核酸 99a 调节来控制卡波西样血管内皮瘤的侵袭性的分子机制。 方法：使用含 20%的胎牛血清的 DMEM 培养基培养一种人的卡波 西样血管内皮瘤的细胞系（SLK）。再分别使用含有过表达的 miR99a 的质粒和小分子干扰 RNA 转染 SLK 细胞，48 小时后通过 RT-qPCR 检 测鉴定 miR99a 表达情况。通过 RT-qPCR、Western blot、酶联免疫吸附 法（ELISA）检测 miR99a 高表达（SLK-miR-99a）和低表达的 SLK 细 胞（SLK-ShmiR-99a）基质金属蛋白酶 7、基质金属蛋白酶 9 和基质金 属蛋白酶 13 的表达，利用 Transwell 细胞体外侵袭实验观察 miR99a 高 表达和低表达的 SLK 细胞侵袭性的变化。在 miR99a 敲除的 SLK 细胞 （SLK-ShmiR-99a）中分别使用 PI3k/Akt 信号通路阻断剂 LY294002 和 ERK/MAPK 信号通路阻断剂 PD98059 进行干扰，通过 RT-qPCR、 Western blot、酶联免疫吸附法（ELISA）检测 miR99a 敲除的 SLK 细 胞基质金属蛋白酶 7 和基质金属蛋白酶 13 的表达。利用 Transwell 细 胞体外侵袭实验观察信号通路阻断剂 LY294002 和 PD98059 对 miR99a 敲除的 SLK 细胞侵袭能力的影响。 结果：通过 RT-qPCR 检测证明 SLK-miR-99a 中 miR99a 表达明显 高于正常 SLK 细胞（p0.05），而 SLK-ShmiR-99a 中 miR99a 表达明 显低于正常 SLK 细胞（p0.05）。通过 RT-qPCR, Western blot 和 ELISA 实验我们发现 SLK-miR-99a 细胞中 MMP7 和 MMP13 的表达明显低于 SLK-N 细胞（p0.05），SLK-ShmiR-99a 细胞中 MMP7 和 MMP13 的表 达明显高于 SLK-N 细胞（p0.05），而三种细胞的 MMP9 表达无明显 3 差异性（p＞0.05）。通过 Transwell 细胞体外侵袭实验发现 SLK-miR-99a 实验组侵袭性明显小于 SLK-N 实验组（p0.05），而 SLK-ShmiR-99a 实验组侵袭性明显强于