急性髓细胞白血病KLF4表达及临床意义-内科学(血液病)专业论文.docxVIP

第二军医大学硕士学位论文 第二军医大学硕士学位论文 急性髓细胞白血病 急性髓细胞白血病 KLF4 表达与临床意义 ‐ ‐ PAGE 4 ‐ ‐ ‐ PAGE 5 ‐ 急性髓细胞白血病KLF4表达及临床意义 摘 要 目的： KLF4作为锌指蛋白类转录因子，在多种组织中均有表达，首先发现其 在上皮细胞表达，进一步发现KLF4在消化道、口腔和食管上皮等处均有表达，在 调控细胞分化及周期进程中扮演着重要的角色，根据靶基因的不同，可激活或抑 制转录，并且，在不同的肿瘤组织中，通过抑制细胞增殖、调节细胞分化、细胞 凋亡和靶基因的表达，发挥着抑制或促进肿瘤形成的双重作用。但KLF4在急性髓 细胞白血病中的作用尚不确切。先就KLF4在髓系白血病细胞株K562 ，U937，HL60 中的表达和作用进行初步探讨，进一步用RT-qPCR的方法检测白血病患者与健康 志愿者骨髓单个核细胞KLF4 mRNA表达进行统计分析，包括以下指标：疾病状态 （初发，缓解，复发），FAB分型，白血病预后监测指标，如年龄，外周血白细 胞数目，骨髓原始细胞比例，CD34表达率，染色体核型的异常，来探索KLF4在AML 中表达及临床意义。并进一步对KLF4及HDACX在急性髓细胞白血病中的相互作用 关系进行研究。 第一部分 髓系白血病细胞系 K562 ，U937，HL60 中 KLF4 表达 方法：采用RT—qPCR及蛋白印迹法检测 KLF4 mRNA、KLF4蛋白在K562,U937，HL60 细胞株和健康人骨髓单个核细胞中的表达。 1， 髓系白血病 K562，U937，HL60 细胞株用含 10％小牛血清的 RPMI 1640 培养 液培养，置于 37℃ ，5％CO2 培养箱中。对照组采用 Ficoll 密度梯度离心法分离 EDTA 抗凝的健康人骨髓单个核细胞。 2， TRIzol 提取细胞总 RNA。 3，取总 RNA 1ug，以 Oligo dT 为引物反转录合成 cDNA 第一链。以此 cDNA 链为 模板进行 SYBR Green I 实时定量 PCR 扩增，以目的基因 KLF4 基因的 Ct 值减 去内参 actin 的 Ct 值为△Ct，以 2-△Ct 计算 KLF4 基因的相对表达量。 4，Western blotting 检测 KLF4 蛋白。 结果： 1，K562，U937，HL60细胞株及健康对照骨髓单个核细胞KLF4 mRNA表达 KLF4 mRNA在K562，U937, HL60细胞中表达，但表达量较低，分别为0.791± 0.090,0.257±0.076, 0.148±0.069。与正常单个核细胞中KLF4的表达1.211± 0.277相比，差异有统计学意义 (P0．05) 2，Western blotting检测健康人骨髓单个核细胞和K562，U937，HL60细胞株中 KLF4蛋白。上述三种细胞株中KLF4蛋白的表达也明显低于正常骨髓单个核细胞中 KLF4蛋白的表达。 第二部分 急性髓细胞白血病中 KLF4 表达与临床预后分析 方法：采用实时荧光定量 PCR、流式细胞术、骨髓涂片及血细胞分析仪等技术检 测了 87 例 AML 患者(初诊患者 39 例、缓解期 40 例，复发 8 例)、10 名健康对照 者中 KLF4 的表达水平，行临床相关资料的统计，评价其与骨髓原始细胞数、外 周血 WBC 及骨髓白血病免疫表型 CD34 表达率及染色体核型的关系。骨髓涂片免 疫化学染色检测 KLF4 蛋白在细胞中的表达情况。 结果： 1, AML 初诊患者 KLF4 表达水平（0.434±0.261），缓解期 AML 患者 KLF4 表达 水平（0.662±0.395），以及复发 AML 患者 KLF4 表达水平(0.196±0.136）均低 于健康对照组(1.211±0.277),P 值均0.01；初诊患者与缓解期，初诊患者与复 发期，缓解期与复发期，两两相比 P 值均0.01。 2, 对于急性 AML 患者，原始细胞增高组，CD34 表达率增高组，以及染色体核型 高危组中 KLF4 表达水平分别低于相应对照组，P 值均0.01. 3, 外周血白细胞增高组 KLF4 的表达低于对照组，P 值0.01。spearman 统计方 法得出 KLF4 表达与外周血白细胞计数负相关，相关系数 R=-0.53。. 4, 骨髓涂片免疫组化证实各型白血病初发病例明显低于健康对照，40×的高倍 镜下见表达 KLF4 蛋白的细胞多为分化成熟的细胞，原始细胞不表达或低表达。 第三部分 KLF4 与 HDACX 在急性髓细胞白血病中的相互关系 方法：不同浓度 VPA（HDAC 抑制剂）作用于 HL60 细胞系，RT-qPCR 检测 KLF4 及 HDAC I 类