激活素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用及其机制的研究-儿科专业论文.docxVIP

山东人学博士学位论文激活素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 山东人学博士学位论文 激活素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用 及其机制的研究 研究生： 安丽 导师： 孙若鹏 摘 要 围产期窒息所致的缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemie encepholopathy,HIE) 是新生儿期危害最大的常见病之一，死亡率和致残率高。最新研究表明，激活素 (activin，ACT)在离体情况下具有神经保护作用，且有助于问质细胞修复。本 研究采用动物实验的方法，研究ACT对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 (bypoxic．ischemic brain damage，HIBD)的保护作用及其机制，旨在为迸一步探 讨HIE的有效防治措施提供实验依据。 1对象和方法 1．1对象 实验对象为新生7曰龄Wistar大鼠共60只，平均体重(15．6-t-3．2)g，雌雄 不拘，由山东大学实验动物中心提供。 1．2 HIBD模型制备和分组 将60只新生7日龄Wistar大鼠随机分为6组，每组10只。即：正常对照组、 假手术组、HIBD模型组及治疗组一i、II、HI(分别给予高、中、低剂量ACT)。 HIBD模型制作：将H1BD对照组及治疗组大鼠于乙醚吸入麻醉后无菌行左侧颈 总动脉结扎术，lh后置于3000ml含8％氧气的氮气仓中缺氧2h，监测氧浓度为 (84-0 5)％．控制仓温(36±1)℃。假手术组只分离左侧颈总动脉即缝合皮肤， 山东大学博士学位论文不造成缺氧缺血(HI)。 山东大学博士学位论文 不造成缺氧缺血(HI)。 1．3治疗 激活素A(ACTA)由美国RD System公司提供。治疗组(I、II、lid于 HI后即刻腹腔注射ACTA 5ml／kg(浓度依次为O．025、O．005、0．001 la g／m1)：其他 各组均腹腔注射生理盐水5ml／kg。 1。4标本采集 各组于HI结束后不同时间点(Oh、2 h、6 h、24 h、48h)依次断颈处死(每 次10只)，测左、右脑重后取左侧脑组织做病理学检查、超微结构观察及细胞凋 亡检测；处死前心脏取血0．5ml，分离血清，--20。C保存，用以检测FGF、TNF 浓度。 1．5组织切片及病理观察 于特定的时间点将实验鼠乙醚吸入麻醉后，经心脏用生理盐水冲洗，然后用 4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液(4℃，pH7．4)灌注，待面部及肢体僵硬后，取脑组 织浸入上述缓冲液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，冠状连续切 片(厚4um)，常规HE染色，光镜下观察组织病理学变化。 1．6透射电镜超微结构观察 取与光镜检查大致相同部位的皮质、海马回组织(1mmb，置入2．5％戊二 醛溶液(0～4C)固定数天后常规固定、包埋、染色，透射电镜下观察脑组织超 微结构变化。 1．7血清TNF—o、FGF水平检测 采用双抗夹心ELISA法。TNF—q和FGF检测试剂盒购自法国的Diaclone 山东大学博士学位论文Research：具体操作程序按说明书进行。 山东大学博士学位论文 Research：具体操作程序按说明书进行。 1．8细胞凋亡检测 取新鲜脑组织，应用流式细胞仪，采用以DNA含量分析为基础的流式细胞 术(FCM)做细胞凋亡分析，以出现亚G1峰(凋亡峰)为特征。细胞凋亡检测 试剂盒由美国BD Biosciences Pharmingen提供，操作步骤按说明书进行。 】．9结果分析及统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示。采用Kmskai—Wallis秩和检验，用 Statistica5．0软件进行。P0．05有统计学意义。 2结果 2．1 脑组织外观及脑重、左右脑重量差值比较 2．1．1脑组织外观 造模结束后(0h)，各组幼鼠脑组织白色圆润，形状和质地均正常，没有出血、 肿块和其他异常。以后的各时间点，模型组和治疗组幼鼠的脑组织肉眼可见有不 同程度的瘀血。其中，模型组最明显且逐渐加重；各治疗组脑组织瘀血情况弱于 模型组，且于造模6h后的各时间点逐渐好转。其中，中剂量治疗组明显好于高、 低剂量治疗组。 2．1。2脑重的比较 造模结束后(Oh)，各组幼鼠脑重无显著性差异。以后各时间点，正常对照 组和假手术组脑重始终无明显变化。治疗组和模型组脑重均逐渐增加，其中以模 型组最为明显；各治疗组脑重的增加值与模型组比较均有显著性差异(P0．05)； 治疗组中，高、低剂量组脑重增加较中剂量组明显，但差异无显著性(，0．05)。 (见表1) 山东大学博士学位论文2．1．3左、右脑重差值的比较 山东大学博士学位论文 2．1．3左、右脑重差值的比较 造模结束后(0h)，各组幼鼠左、右脑重的差值均无显著性差异(尸0．05)。以 后各时间点，正常对照组和假手术组左、右脑重的差值始终无明显变化。治疗组 和模型组左、右