鸡球虫核酸疫苗的研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

中文摘要鸡球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病。目前主要靠药物防治。近年米，由于球虫耐药 中文摘要 鸡球虫病是严重危害养禽业的一种寄生虫病。目前主要靠药物防治。近年米，由于球虫耐药 性的产生及消费者对绿色食品的呼唤，人们开始寻找其它的防治措施。核酸疫苗以其可诱导产生 较强的细胞免疫反应等优点而倍受青睐，己在一些传染病及肿瘤的防治上取得一定进展。球虫病 对中国养禽业的危害也相当严重，为了研究核酸疫苗对球虫感染的防治效果，我们进行了如下试 验： 1．球虫EtlA基因的克窿以Eimeria tenella BJ株孢子化卵囊总RNA为模板进行RT-PCR。 按照GenBank发表序列合成引物，引物上下游加上BamH I和EcoR I酶切位点．以利于插入载 体中。扩增产物与pG跚-T相连接后．转化Jlll09感受态细胞，将经PER和酶切鉴定正确的阳性 克隆进行测序。结果表明，扩增产物大小为1978bp，ORF大小为1944bp：与Kramer等(1993) 克隆基因的同源性为99．5％．有6个部位、共7个碱基发生了突变．其中5个有意义突变，2个 无意义突变。与报道的E．acervulina的EalA基因的同源性为79．8％。推测的表达产物与核苷酸 转氢酶功能相似，估计可为子孢子入侵宿主细胞提供能量． 2．TA4基因的衰选及薹定球虫子孢子表面抗原TA4(25kDa)是通过二硫键连接8kDa 和17kDa两条多肽形成的。在孢子化后期合成。E．tenella BJ株的1A4基因同国外株的同源性为 99％。本试验进行了1’A4基因的表达。表达产物免疫鸡后，分离血清．以为DNA疫苗的检测提 供抗体。试验发现，以pGEx-KG为载体，用IPTG可诱导1’A4基因在E．coli BL21(DE3)中的表 达。SDS表明．融合蛋白大小约43kDa，而非推测的51kDa．诱导6h的蛋白表达量即可达 到较高水平，表达量约为31％。采用抗GST抗体进行Western．blot，成功检测到了特异性条带。 说明SDS前的样品煮沸处理可使连接1A4两条多肽的二硫键断裂，只有17kDa的多驮可 与26kDaGST蛋白结合。样品采用反复冻融法处理，加入还原型谷胱苷肽后，采用GST凝胶回 收柱Sepharose 4B纯化的融合蛋白主要为51kDa的单一条带，煮沸变性后电泳．则43kDa带含 量增加。说明纯化过程可影响GST-TA4融合蛋白的特性。 3．真棱衰达麓体pCT和I，c-TE的构建、体外衰选及箕对球虫矗染的防治效果研究将TA4 基因插入真核表达载体pcDNA3．1中，然后在其上游融合方式插入E．tenella BJ株的EtlA基因， 构建成核酸疫苗pcDNAoTA4(pcD和pcDNA-EtlA．TA4(pCTE)，采用脂质体介导转染COS细 胞进行体外表达，并用IFAT检测，均获得成功。采用MTr法进行淋巴细胞转化试验，表明中剂 量(50ttg)的pCT具有较强的诱导鸡的细胞免疫反应的能力。 采用25Vo．蔗．糖局部胸肌预处理后10～15min．用核酸疫苗间隔一周两次免疫鸡，一周后采用 3 X 10E．tenella BJ株孢子化卵囊攻虫发现．pcT和pcTE对球虫感染具有明显的保护作用，可显 著减轻球虫感染引起的机体增重下降。其中．重组干扰素联合核酸疫苗pCT中剂量(5099)免 疫时，鸡的增重效果最为明显，相对增重率达到108．80％，盲肠病变值也最为轻微．ACl达167．2。 试验还发现，50p．g pCTE可以达到10099pCT的抗球虫效果，ACI在160以上，说明融合插入两 种基因可节省一半的疫苗用量．从而降低疫苗生产成本。 关键词l核酸泼茁．球虫病，免疫，鸡． Research Research on DNA Vaccine against Chicken Coccidiosis Ph．D Candidate-Wu Shaoqiang Supervisor：Jiang Jinshu ABSTRACT Avian coccidiosis is an economically important disease for the poultry industry throughout the world．Many methods besides chemotheraphy have been exploced to eliminate its damage due to the increasing emergence of drag-resistant strains and the consumers’appeal for grin food．Recently, novel vaccinating strategies using antigen