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鸭胚成纤维细胞T7噬菌体cDNA文库的构建 CONSTRUCTION OF A T7 PHAGE DISPLAY cDNA LIBRARY FROM DEF 报告人：王权威 专 业：动医092 导 师：李小康 目的意义 鸭胚成纤维细胞是研究禽类病毒与细胞间相互作用的重要细胞模型，本实验旨在构建鸭胚成纤维细胞T7噬菌体cDNA文库，以期从构建的鸭胚成纤维细胞T7噬菌体cDNA文库中筛选出不同病毒的相关受体，为进一步研究鸭胚成纤维细胞蛋白相互作用提供实验研究平台。 实验方法 一 、鸭胚成纤维细胞cDNA片段和受体臂的连接 选用中等拷贝数且能呈现较大蛋质的T7Select 10-1载体，按照插入序列与载体摩尔比为3：1的进行连接。 二、体外包装 连接反应一结束就可加入T7包装提取物进行体外包装 。 三、鸭胚成纤维细胞T7噬菌体原始cDNA文库的测定 （1）滴度测定：噬菌斑计数，计算文库滴度。噬菌体滴度，用噬菌斑形成单位（pfu）表示，每单位体积是在稀释倍数乘以10再乘以板上噬菌斑的数量 。 （2）重组子鉴定 ：随机挑取8个克隆菌落，用T7Select引物进行PCR扩增，取5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测重组子比例 。 实验结果 一、鸭胚成纤维细胞T7噬菌体初始cDNA文库的滴度 结果如下图，可以看到在10-3稀释梯度时约有120个噬菌斑可以看到在10-4稀释梯度时有12个噬菌斑，通过比较、计算，可得鸭胚成纤维细胞T7噬菌体原始cDNA文库滴度为：12×104×10=1.2×106 pfu/mL 图1-A 原始文库10-3稀释梯度噬菌斑 图1-B 原始文库10-4稀释梯度噬菌斑 10-3 10-4 二、 重组子鉴定 如下图，经过计算，重组率为63％，片段大小主要集中在100bp～750bp之间。 图2 原始文库重组子PCR鉴定结果 —2000 bp —1600 bp —1000 bp —750 bp —500 bp —250 bp —100 bp 三、鸭胚成纤维细胞T7噬菌体cDNA文库的扩增及滴度测定 如上利用噬菌斑计数法测定文库的滴度，结果如下图。可以看到在10-8稀释梯度时约有210个噬菌斑可以看到在10-9稀释梯度时有21个噬菌斑，通过比较、计算，则扩增后的鸭胚成纤维细胞T7噬菌体cDNA文库滴度为21×109×10=2.1×1011 pfu/mL。 图3-A 原始文库10-8稀释梯度噬菌斑 图3-B 原始文库10-9稀释梯度噬菌斑 10-8 10-9
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