仙人掌杆菌几丁质酵素的过量表现与催化反应机制的探讨.PDF

國 立交通 大學 應用化學研究所 碩 士論 文 仙人掌桿菌幾丁質酵素的過量表現 與催化反應機制的探討 Overexpression and mechanistic study of Bacillus cereus NCTU2 chitinase 研 究 生：蔡蕙如 指導教授 ：李耀坤 博士 中 華民 國 九 十 三 年 七月 仙人掌桿菌幾丁質酵素的過量表現與催化反應機制的探討 學生：蔡蕙如 指導教授 ：李耀坤 博士 國立交通大學應用化學研究所碩士班 摘要 從 Bacillus cereus NCTU2選殖出來的含訊息月生 肽幾丁質酵 素基因 建構 於載體pET-22b(+)上，成功於大腸桿菌BL21 (DE3)中大量表現 ，胞內酵素 經疏水性管柱層析 ，得到 90%以上均質度之幾丁質酵素，命名為 ChiNCTU2 ，以電灑式質譜儀分析其分子量為36236 Da ，此與成熟蛋白之分 子量吻合 ，顯示此訊息 月生 肽可被 大腸桿菌辨識而遭切除。 重組酵素穩定性高 ，反應最佳活性在 pH 約5.5 左右，在 pH 6.0 MES 緩衝液條件下 ，對PNPCB的反應活性之 Km 為 0.27 mM ，kcat 為 66.0 s-1 。 由 BrØnsted plot顯示 ChiNCTU2 為兩步驟水解反應機制中間體的生成- 與水解 ，反應中間體的水解步驟是速率決定步驟 。由突變株酵素 E145G 與 受質反應過程呈現的雙相動力反應現象 (biphasic kinetic) ，顯示有中間體累 積 ，此亦證實中間體水解為速率決定步驟。在 Sodium azide濃度為 2.5 M時 可增強 突變株E145G 對受質2,4-DNPCB的反應速率近 100% ，顯示催化反 應機制極可能是 anchimeric assistance ，其反應中間體為oxazoline ring 。 經胺基酸比對，E145 與Y213和 Serratia marcescens ChiA (subfamily A) 之 E315 與Y390位於相同保留區 ，經突變後E145G 、E145C和 E145Q 之 kcat值較野生株下降 3900 ~ 9100倍 ，kcat /Km下降 2900 ~ 5300倍 ，證實 E145 為 ChiNCTU2催化作用之重要胺基酸 。然而Y213F的催化活性 kcat 與kcat /Km 與野生株相近 ，顯示 Y213 對subfamily B的 ChiNCTU2 不是參 i 與水解反應的重要基團故推論， ChiNCTU2 與S. marcescens ChiA 之結構與 催化機制可能不同 。 ii Overexpression and mechanistic study of Bacillus cereus NCTU2 chitinase Student ：Huei-Ju Tsai Advisor ：Dr. Yaw-kuen Li Department of Applied Chemistry National Chiao Tung University ABSTRACT A gene of family 18 chitinase from Bacillus cereus NCTU2 was constructed in pET-22b(+) and over-expressed by E. coli BL21 (DE3) strain.