分子克隆的工具酶课件.ppt

PvuII BamHI BclI BglII XhoII MboI Sau3AI 识别位点中含GATC序列 ClaI(1/4) XbaI (1/16) TaqI (1/16) MboII (1/16) HphI(1/16) 部分识别序列含GATC序列 4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列 有些限制酶对Dam甲基化敏感 不能切割相应的序列 BclI, ClaI, MboI, XbaI 等 不敏感的有 BamHI, Sau3AI, BglII, PvuI等 一般哺乳动物DNA 不会在A-N6上甲基化 当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam- E.coli中提取DNA 2. Dcm甲基化酶 识别CCAGG或CCTGG序列 在第二个C上C5位置上引入甲基 EcoRII / BstNI CCA(T)GG 二者识别序列相同，但切点不同 EcoRII受dcm甲基化作用影响 BstNI可避免这一影响 受影响酶有： Acc65I GGTACC AlwNI ApaI GGGCCC EcoRII EaeI 等 不受影响酶有： KpnI GGTACC BanII Bg1I BstNI NarI GGCGCC 等 二、甲基化对限制酶切的影响 1. 修饰酶切位点 ① HincII GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割 ② BamHI GGATCC M.MspI m5CCGG 如果BamHI前面为CC或后面为GG， 那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割 ③ 构建DNA文库时 用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部分消化基因组DNA 用M.EcoRI甲基化酶处理， 然后加上合成的EcoRI接头 当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割 2. 产生新酶切位点 TCGATCGA AGCTAGCT TaqI TaqI M.TaqI TCGA*TCGA* *AGCT*AGCT DpnI 第三节 DNA聚合酶 DNA polymerase 催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相辅的活性 真核细胞有 4种 DNApoly ?：也许是复合物，位于细胞核内，有催化细胞增生的作用。 ?：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺出提出，与细胞增生无关。 ?：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高。 其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA的合成。 原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关 I．单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长 II 与低分子脱氧核苷酸链的延长有关 III 在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶 一、大肠杆菌DNA聚合酶 I Ecoli DNA polymerase I 1. 活性 单链多肽(109kDa) 三种活性 ① 5’→3’DNA聚合酶活性 底物: 模板(ssDNA), 引物（带3‘OH基） 或 5’突出DsDNA Mg2+ dNTP DNApolyI ②5’→3’外切核酸酶活性 底物: dsDNA or DNA: RNA杂交体 活性：从5’端降解dsDNA，也降解 RNA:DNA中的RNA(RNase H 活性) Mg2+ DNApolyI + dNTP ③3’→5’外切酶活性 底物：3’-OH dsDNA or ssDNA 活性：从3’-OH端降解DNA，可被5’→3’聚合活性封闭。 Mg2+ DNApolyI + dNTP Mg2+ DNApolyI + dNTP Proof reading 反应平衡 过量dNTP 平端 2. 用途 ①切口平移法标记DNA Nick translation （所有DNApoly中只有此有此活性） Mg2+, 低限量DNase I dNTP DNApoly I 产生切口 切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5’--3’方向平移 若有放射性dNTP, 则可标记成探针 ② 用于cDNA克隆中的第二链 即单纯的DN