抗胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)全人源单链抗体的筛选及特性分析论文-医学免疫学专业毕业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 四川医科大学硕士学位论文敏性炎症疾病提供新的治疗途径。 四川医科大学硕士学位论文 敏性炎症疾病提供新的治疗途径。 方法：扩增TSLP cDNA，将目的基因与表达载体pETl01／D．TOPO连 接，转化大肠杆菌BL2 1，IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。以 生物素化TSLP蛋白为抗原利用噬菌体展示技术对前期构建的天然抗体 文库进行3轮富集，用ELISA检测技术从富集的单链抗体文库中筛选抗 TSLP全人源单链抗体(scFv)。用BstN I酶切方法对筛选抗TLSP．scFv 阳性克隆子进行指纹图谱分析；将指纹图谱不同的克隆子连接LZl6载 体，转化大肠杆菌BL21后进行表达纯化，用Dm blm及WeStem blm方 法对表达纯化的抗TLSP．scFv蛋白进行鉴定；用间接非竞争ELISA分析 纯化后抗TLSP．scFv抗体效价；用竞争ELISA方法检测scFv和TSLP受 体与TSLP的竞争结合，分析scFv与TLSP受体是否作用于TSLP的同一 抗原表位，从而达到封阻TSLP与受体结合的功能；用大分子相互作用分 析技术对抗TSLP全人单链抗体进行特异性及亲和力分析。 结果：①．TSLP抗原的表达纯化及鉴定：对TSLP基因的开放阅读 框(ORF)进行了PCR扩增，扩增的TSLP cDNA片段大小为423 bp左右； 将cDNA与pETl01／D．TOPO连接，转化BL21进行表达，表达的TSLP 蛋白大小为26 KDa左右；Dot blot及Western blm鉴定显示表达的蛋白正 确，为TSLP目的蛋白。②．抗TSLP全人源单链抗体筛选与表达：以生 物素化TSLP蛋白为抗原，采用噬菌体展示技术对全人源抗体文库进行3 轮富集，通过ELISA检测有35％的scFv与TSLP有结合特性；将与TSLP 结合能力强的单链抗体基因与原核分泌性表达载体LZl6相连接，构建重 组表达载体scFv．LZl6，对单链抗体进行表达及纯化，结果显示scFv在大 万方数据 四川医科大学硕士学位论文肠杆菌DH5aF’中主要为分泌性表达，表达产物主要集中在细胞周质问，为 四川医科大学硕士学位论文 肠杆菌DH5aF’中主要为分泌性表达，表达产物主要集中在细胞周质问，为 可溶性表达，抗体具备生物学活性。③．抗TSLP全人源单链抗体特性分 析：SDS．PAGE电泳显示纯化后的单链抗体大小为27 KDa左右，Dot blot、 Western blot及测序结果显示表达纯化的单链抗体蛋白正确；非竞争ELISA 实验结果显示表达的单链抗体可与抗原良好结合，对单链抗体进行倍比稀 释，随着单链抗体蛋白浓度降低，与抗原结合能力随之降低，单链抗体最 低可以稀释至100倍；大分子相互作用实验(Blitz)结果显示抗TSLP全 人源单链抗体特异性好，与其他相关细胞因子没有交叉反应，与相应抗原 TSLP反应较好且得到亲和力KD值为1 O～，可见筛选得到抗TSLP全人源 单链抗体有较高特异性和亲和力；竞争ELISA结果显示：TLSPR和筛选 的单链抗体可竞争性的与TSLP结合，说明TSLPR和单链抗体作用于 TSLP的相同抗原表位，可有效封阻TSLP．TSLPR信号通道具有生物学功 能。 结论：成功筛选到有较高特异性和亲和性并有生物学功能的抗TSLP 全人源单链抗。 关键词：TSLP；人源单链抗体；筛选 万方数据 四川医科大学硕士学位论文Analysis 四川医科大学硕士学位论文 Analysis and identification of full human scFv against TSLP Abstract：bjectiveAntibody for the corresponding Antigen has the characteristics of high affinity and high specificity to make antibody in the diagnosis and treatment of disease has shown incomparable advantages of other types of drugs．Antibody drug has undergone monoclonal antibodies， Polyclonal Antibodies，recombinant antibody in three stages．Polyclonal Antibody from mixture b cells produce antibodies，relatively high affinity but the specificity is bad；comes from a single b c