玫瑰微球菌麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在大肠杆菌中的表达-制药工程专业毕业论文.docxVIP

摘要玫瑰微球菌麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在大肠杆菌中的表达 摘要 玫瑰微球菌麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在大肠杆菌中的表达 摘要 海藻糖(Trehalose，0【．D-glucopyranosyl．O【一D．glucopyranoside)是由两个 葡萄糖分子经半缩醛羟基结合而成的非还原性双糖，其具有的独特生物学 特性可以保护生物大分子抵抗不良的环境压力。近十年来，其广泛的应用 前景引起了各国科学家对其研究的极大兴趣。本实验室前人已克隆了玫瑰 微球菌QS412中产海藻糖相关酶体系基因。本文主要致力于采用基因工程 的手段，构建基因工程菌，实现麦芽寡糖基海藻糖水解酶 (maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase)在大肠杆菌中的表达 和酶活性研究。 首先设计引物克隆玫瑰微球菌QS412中麦芽寡糖基海藻糖水解酶的 基因treZ，插入表达载体pET一28a(+)中，构建重组质粒pET—MTH，使得重 组菌株E coli BL21(DE3)(pET-MTH)在LB培养基中，28℃用O．1mmol／L IPTG诱导8h，表达融合蛋1兰t6His．MTHase，外源蛋白表达量占菌体总蛋白 的30％。 收集发酵液菌体，洗涤破碎，测定破碎全菌液酶活，得每升发 酵液所得酶活是44U。 载体pET-MTH在E coli BL(DE3)中表达的His—MTHase融合蛋白绝 大部分以包涵体形式存在。温度是影响蛋白表达水平和菌体生长的最主要 因素，经过4C37(2温度范围，和0．04一-1 mmol／L IPTG诱导剂浓度范 围进行诱导，发现二者对提高酶活无显著影响，最后确定重组菌的发酵诱 I 北京化工大学硕士学位论文导条件为28℃，O．1 北京化工大学硕士学位论文 导条件为28℃，O．1 mmol／L IPTG，诱导6h。对破碎菌体所得的包涵体， 本文进行洗涤、溶解、尝试透析复性，并对复性后蛋白进行酶活检测，但 检测不到酶活，可能复性后的空间结构不对。 考虑到T7启动子太强导致表达的外源蛋I刍His．MTHase绝大部分以包 涵体形式存在，尝试将treZ基因插入到带弱启动子的载体中。采用了清华 大学化工系李强老师自主构建的组成型表达载体，构建了重组质粒 pGEMKT-HPf-MTH，转化入大肠杆菌宿主菌中，但没有明显的表达，也 检测不到酶活。 综上，本文的工作使得来源于玫瑰微球菌QS412麦芽寡糖基海藻糖水 解酶基因在大肠杆菌中实现了活性表达，为进一步更换表达载体和宿主 菌，实现基因工程菌表达重组蛋白的高酶活奠定了基础。 关键词：玫瑰微球菌，海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶，蛋白表达， 酶活 耐—Z n CLONING CLONING AND EXPRESSION OF MALTOOLIGOSYLTREHALOSE TREHALOHYDROLASE IN E coli FROM MICROCOCCUS ROSEUS QS412 ABSTRACT Trehalose is a non．reducing disaccharide consisting of two a一1，1 linked glucose molecules and has about half the sweetness of sucrose．It is an unusual sugar as compared with other disaccharides,and is widely distributed in vanous orgamsms· A gene encoding the maltooligosyltrehalose trehalohydrolase(MTHase) f如m Micrococcus roses QS4 1 2 Was cloned and inserted into pET expression system．Then the gene Was expressed in E coil strain BL2 1(DE3)·IPTG Was used to induce the recombinant plant E coil BL2 1(DE3)(pET28-MTH)．The molecular mass of the recombinant enzyme was estimated to be 69 kDa at 8％ SDS．PAGE．And also，we studied that the recombinant enzyme can’ 怕J|l specifically hydrolyzed the maltooligosyltrehalose to release free trehalos