5-氮杂-527-脱氧胞苷的合成工艺优化及其对SKOV3作用的研究.docVIP

安徽医科大学硕士论文 rpm revolutions per minute 每分钟转数 RSD relative standard deviation 相对标准差 SAM S-adenosylmethionine S-腺苷甲硫氨酸 TLC thin-layer chromatography 薄层色谱法 TMSOTf Trimethylsily Trifluoromethanesulfonate 三氟甲磺酸三甲基硅酯 UV ultraviolet spectrophotometry 紫外分光光度法 μg microgram 微克 μl microliter 微升 μm micrometer 微米 - 2 - 安徽医科大学硕士论文 5-氮杂-5-脱氧胞苷的合成工艺优化 及其对 SKOV3 作用的研究 研究生 李飞龙 导 师 李 俊 教授 汤文建 副教授 安徽医科大学药学院 中文摘要 多数肿瘤细胞的DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, DNMT）水平表达 明显高于正常细胞，并与抑癌基因启动子高甲基化状态相关，DNMT抑制剂类药 物是一类通过抑制DNMT的活性、逆转基因的异常甲基化状态，从而达到抗癌效 果的药物。 胞苷类似物作为DNA甲基化酶抑制剂，能够逆转基因的甲基化状态，从而恢 复基因的表达水平，纠正肿瘤细胞的异常生物学特征，在肿瘤研究中受到极大的 关注。本课题前期以双氰胺为原料合成、分离得到5-氮杂-5-脱氧胞（5-Aza-5- deoxycytidine, 5A5DC），实验证实了β-异构体有着较强的生物活性。但在合成方面， 存在催化剂价格过高、反应时间长、纯化方法复杂等缺点。因此本文旨在优化其 合成工艺、降低成本、提高产率，并探讨5A5DC对SKOV3的增殖及细胞周期的影 响。 具体研究工作分为以下两个部分： 5-氮杂-5-脱氧胞苷（5A5DC）的合成及工艺优化 通过分析各种核苷类化合物的合成方法，确定了本文的合成路线: 5-氮杂胞嘧 啶经硅烷化保护，在路易斯酸作用下与 1,2,3-三乙酰基-5-脱氧-D-核糖进行偶联得 - 3 - 安徽医科大学硕士论文 2,3-二乙酰氧基-5-脱氧-5-氮杂胞苷，最后经碱性脱保护、乙酸乙酯重结晶得 5A5DC。通过正交设计，比较在Hilbert-Johnson偶联反应中不同Lewis 酸、溶剂和 反应时间对合成5A5DC的影响。以无水SnCl4为Lewis 酸，1,2-二氯乙烷为催化剂、 反应时间为8 h时，5A5DC的收率最高。以双氰胺计，总收率为31 %。 5A5DC 对卵巢癌细胞株 SKOV3 的影响 5A5DC 对 SKOV3 细胞生长曲线的影响 SKOV3对数期生长期细胞，加入不同浓度的5A5DC，台盼蓝染色后光镜下进 行细胞计数，连续计数7 d，绘制生长曲线。5A5DC对SKOV3细胞增殖具有不同程 度的抑制作用, 呈现剂量依赖关系。剂量愈大，生长曲线愈低平。其中剂量大于 100 μmol/L抑制作用较为明显。 MTT 法检测 5A5DC 对 SKOV3 细胞增殖的影响 SKOV3 对数期生长期细胞，加入不同浓度的 5A5DC，MTT 法检测 5A5DC 对 SKOV3 细胞增殖抑制的影响。5A5DC 作用细胞 72 h 后，对 SKOV3 具有不同程度 的抑制作用，呈现剂量依赖关系，其中以 200 μmol/L 抑制效应最为强。 流式细胞术检测对 SKOV3 细胞周期的影响 流式细胞仪检测5A5DC作用SKOV3细胞72 h后，SKOV3细胞周期变化情况， 当5A5DC的浓度达到100 μmol/L以上，细胞周期的G0/G1期明显受到阻滞。 关键词：5-氮杂-5-脱氧胞苷；Hilbert-Johnson偶联反应；Lewis酸；SKOV3。 - 4 - 安徽医科大学硕士论文 Study on synthesis and activity of SKOV3 of 5-Aza-5-deoxycytidine Ph.M Candidate: Li Feilong Supervisor: Prof. Li Jun School of Pharmacy, Anhui Medical Universioty, Hefei, PR.China Abstract The expression level of DNA methyltransferase (DNA methyltransferase, DNMT) of most tumor cells was higher than normal cells, and relevant with the hypermethylation status of tumor suppressor gene prom