慢性温和应激加速动脉粥样硬化病变形成及Toll样受体4途径的作用研究-病理学与病理生理学专业毕业论文.docx

PAGE PAGE 3 放入鼠笼中以代替灭菌的蒸馏水，接着禁食禁水 8h，通过称饮水瓶前后重量， 连续测量 3 次动物在 1h 内的饮水量，计算方式如下： 饮用 1％蔗糖水重量＝饮用前饮水瓶的重量-饮用 1h 后饮水瓶的重量 此后每周进行一次 8h 禁食禁水和 1h 饮蔗糖水测试。采用 125I-皮质酮放射性免疫 检测试剂盒测定血浆皮质酮的含量，此过程贯穿于整个实验。 1.3 CMS 对 apoE-/-小鼠主动脉 AS 病变面积测定 从腹主动脉分叉至主动脉弓将主动脉剪下，干净剔除主动脉血管外的脂肪组 织后，将主动脉树纵向剪开，主动脉树以用苏丹Ⅳ染色观察整个主动脉的病变。 主动脉窦连续 10μm 冰冻切片进行油红 O 染色，观察主动脉 AS 病变。 1.4 CMS 对 apoE-/-小鼠 TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和 TNF-α 基因表达 水平的测定 Real-time PCR 芯片分析 apoE-/-小鼠主动脉 TLRs 信号途径基因表达； Western blotting 方法检测 apoE-/-小鼠主动脉 TLR4 和 NF-κB 的表达水平，免疫 组化染色观察主动脉窦 AS 病变处 TLR4 的表达；ELISA 法检测 apoE-/-小鼠血清 中的 MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和 TNF-α 表达水平。 2. Ad-TLR4 siRNA 干扰对 CMS apoE-/-小鼠主动脉 AS 发生、发展及其对主动脉 TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和 TNF-α 基因表达的研究 2.1 Ad-TLR4 siRNA 干扰载体构建 2.1.1 有效封闭 TLR4 表达的小分子干扰 RNA 载体构建 设计、合成两对特异性针对 TLR4 基因的小分子干扰 RNA 序列，分别构建 小分子干扰 RNA 载体 pRNAT-TLR4-1 和 pRNAT-TLR4-2 ； 阴 性 对 照 为 pRNAT-H1.1/Adeno 空载体。DNA 测序鉴定重组质粒的正确性。 2.1.2 有效封闭 TLR4 表达的小分子干扰 RNA 载体筛选 收集稳定筛选获得的 293A- Ad-siRNA-TLR4-1、293A- Ad-siRNA-TLR4-2 和 293A-pNeg 细胞，抽提各组细胞的总 RNA 和总蛋白，分别以 Real time-PCR 与 Western blotting 法检测各组细中 TLR4mRNA 与蛋白的表达水平；选取对 TLR4 抑制率高的一对进行体外大量扩增。 2.1.3 小分子干扰腺病毒载体的体外扩增、滴度测定 以上大量扩增获得的 Ad-siRNA-TLR4-2、Ad-siRNA-Neg 腺病毒以不同浓度 感染 293A 细胞，逐孔稀释滴度测定法检测病毒滴度。 2.2 TLR4 siRNA 干扰对 CMS apoE-/-小鼠主动脉 AS 发生、发展影响的研究 4 周龄雄性 apoE-/-小鼠 120 只平衡一周后随机分为 3 组：（1）CMS 组；（2） CMS＋TLR4 siRNA 组（10μl/只，尾静脉注射，每 5 日一次）；（3）CMS＋腺病 毒空载体组。每组 apoE-/-小鼠 40 只，实验动物都以高脂、高胆固醇饲料（5％猪 油，1％的胆固醇）的喂养。分别在接受 CMS 刺激 0，4，12 周后 3 个时间点处 死动物。主动脉窦连续 10μm 冰冻切片进行油红 O 染色，观察主动脉 AS 病变。 2.3 TLR4 siRNA 干扰对 CNS apoE-/- TLR4/NF-κB-MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和 TNF-α 基因表达水平的测定 分别以 Real-time PCR 方法检测 apoE-/-小鼠主动脉 TLR4 和 NF-κB mRNA 表 达水平；以 Western blotting 方法检测其主动脉 TLR4 和 NF-κB 蛋白质表达水平； ELISA 法检测 apoE-/-小鼠血清中的 MCP-1、ICAM-1、IL-1β 和 TNF-α 表达水平。 结果 1. CMS 显著升高 apoE-/-小鼠血浆糖皮质激素水平 结果显示：对照组小鼠血浆中皮质酮的浓度小于 100ng/ml；CMS 组 apoE-/- 小鼠应激 4 周后，CMS 组小鼠血浆中的皮质酮激素的水平显著高于正常对照组； 而应激 12 周后，CMS 组小鼠血浆皮质酮激素浓度大约是对照组的 11 倍，与相 应对照组相比，其血浆皮质酮激素浓度差异有非常显著（457.3 ± 56.5 ng/ml vs 40.2 ± 7.2 ng/ml，P 0.001）。 2. CMS 显著降低 apoE-/-小鼠 1%蔗糖水溶液摄取量 结果表明：基线测试中应激