利奈唑胺在大鼠血、脑组织和脑脊液中药代动力学的研究.docVIP

四 第一部分 大鼠血清、脑组织和脑脊液中利奈唑胺药物浓度测定 的方法学研究 国内目前只有少数研究使用高效液相色谱（HPLC）测定利奈唑胺血药浓度，尚未见 在脑脊液及脑组织中测定利奈唑胺浓度方法的报道。国外有报道脑脊液利奈唑胺的监测 方法，但是这些方法在样品处理上都比较繁琐，如固相萃取、在线提取技术等。本实验 建立了快速简单准确的测定利奈唑胺浓度的 HPLC法。对利奈唑胺在静脉给药后的大鼠 血、脑组织和脑脊液中的药物浓度及药动学参数进行研究，以期为利奈唑胺在临床使用 抗感染的患者中提供理论依据。 1 材料 仪器 岛津 LC-20AD高效液相色谱仪，包括二级阵列管检测器，CTO-10ASUP柱温箱，SIL-20A 自动进样器(日本岛津公司)，ＨＰ-１真空脱气机，ＷＤ-９４１５型超声清洗器（北京 六一机器厂），ＴＧ１６-ＷＳ台式高速离心机，ＸＤ-８０Ａ涡旋混合器，微量进样器。 试药及试剂 利奈唑胺原料（湖北兴银河药业有限公司，纯度：99.1%,批号：1658-03）；乙腈（色 谱纯）、甲醇(分析纯)；蒸馏水。 动物 SD大鼠，体重（200±15）g。 2 方法与结果 ２.１色谱条件 开机前，流动相使用必须先过 0.45um的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水 相必须用新鲜蒸馏水），同时对流动相进行超声脱气 10-20分钟，色谱柱为 Inertsil ODS-SP柱(4.6×250mm，5μm)；流动相：水：乙腈（75:25，V/V）；柱温 30℃；流速 1ml/min；检测波长 254mm；进样量 90μL ,维持 20min结束。 样品预处理及进样 血浆样品 取血浆样品 1ml置 5ml具塞试管中，先使用低转速离心（5000 ｒ.min－１）10分钟，取上清液 100μL，转移至另一离心管中。加入甲醇 200μL，于涡 旋混合器上漩涡混合５分钟，待蛋白充分沉淀，将试管放入高速离心机中离心（16000 ｒ.min－１）15分钟，避光环境下取上清液，进样 90μL分析。 8 脑组织样品 大鼠处死，断头，取全脑，用滤纸蘸净血迹,并尽量去除血管， 脑组织精密称重，至匀浆器中，加入 1.5倍量生理盐水，捣碎使成匀浆，将匀浆液置试 管中，同样先使用低转速离心（5000ｒ.min－１）10分钟，取上清液，转移至另一离心 管中。加入两倍体积的甲醇，于涡旋混合器上漩涡混合５分钟，待蛋白充分沉淀，将试 管放入高速离心机中离心（16000ｒ.min－１）15分钟，避光环境下取上清液，进样 90 μL分析。 脑脊液样品 使用微量进样器抽取清亮脑脊液 100μL后，加入甲醇 200μL， 于涡旋混合器上漩涡混合５分钟，待蛋白充分沉淀，将试管放入高速离心机中离心 （16000ｒ.min－１）15分钟，待蛋白沉淀后，避光环境下取上清液９０μL进样分析。 方法专属性 分别取大鼠空白血浆、脑组织以及脑脊液样品，按“样品预处理”项下操作，进样 90μL。取注射利奈唑胺后大鼠血、脑组织、脑脊液样品同法操作。在上述同样色谱条 件下分离测定，结果表明，利奈唑胺在血浆、脑组织及脑脊液中出峰时间在 14min左右， 空白血浆、脑组织及脑脊液中内源性物质出峰时间在 5min内，空白血浆、脑组织及脑 脊液中内源性物质不干扰利奈唑胺的测定，利奈唑胺出峰良好。利奈唑胺对照品、空白 大鼠血清、大鼠血清样品、空白大鼠脑组织、大鼠脑组织样品、空白大鼠脑脊液、大鼠 脑脊液样品色谱图见图 1。 图 1：大鼠血、脑组织、脑脊液色谱图 A.利奈唑胺对照品 t/min 9 B.空白大鼠血清 t/min C.血清样品 t/min D空白大鼠脑组织 t/min E 脑组织样品 t/min G F.空白大鼠脑脊液 t/min G.脑脊液样品 t/min 标准曲线制备 血浆样品 取大鼠空白血浆，精密加入适量利奈唑胺标准液，制成含利奈唑 胺 0.2,0.5,1.0,5,10,20,30,50μg/ml的标准血浆样品，取标准血浆样品于具塞试管 中，离心取上清液，转移至另一离心管中。加入 2倍的甲醇溶液，漩涡混合５分钟，充 分沉淀蛋白，离心（16000ｒ.min－１）15分钟，避光环境下取上清液，进样 90μL分析， 记录色谱图，以利奈唑胺峰面积(Y)为纵坐标，利奈唑胺质量浓度（X）为横坐标进行线 10 性回归，得标准曲线，回归方程 Y= 96036X-20485 r=0.9995,，利奈唑胺的线性范围 为 0.2～50ug/ml，定量下限为 0.2ug/ml。 脑组织 大鼠处死后，取完整脑组织，尽量去除血迹及血管，精密称量大脑 重量，准确加入适量利奈唑胺标准液，制成含利奈唑胺 0.2，0.5,1，5，10,20,30,50 μg/g的标准脑匀浆样品，按“脑组织样品预处理”项下操作，进样 90μL分析，